7.2 其他qPCR方法

荧光标记的探针提供了一种高度灵敏的检测方法，因为只检测到所需的PCR产物。然而，当使用序列特异性探针时，PCR特异性也很重要。还可能产生非特异性PCR产物和引物－二聚体等扩增产物，这可能导致所需PCR产物的产率降低。特定产物和反应产物之间对反应组分的竞争可能会损害测定灵敏度和效率。

*具体流程请参考货号为208252的QIAGEN产品说明书。

实时RT-PCR可以在两步或一步反应中进行(见图两步和一步RT-PCR的比较和不同RT-PCR程序的优点表)。使用两步实时RT-PCR，首先使用寡聚dT引物、随机寡聚物或基因特异性引物将RNA逆转录为cDNA。然后将逆转录反应的等分试样加入实时PCR中。根据实验需要，可以在不同类型的RT引物之间进行选择。使用寡聚dT引物或随机寡聚物进行逆转录意味着可以通过PCR从单个RT反应中分析几种不同的转录物。此外，珍贵的RNA样本可以立即转录成更稳定的cDNA，供日后使用和长期储存。

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在一步RT-PCR(也称为单管RT-PCR)中，逆转录和实时PCR都在同一管中进行，逆转录先于PCR。这可能是由于专门的反应化学和循环方案(见一步RT-PCR的条件)。该快速程序能够快速处理多个样本，并且易于自动化。处理步骤数量的减少导致样品之间的高再现性，并将污染风险降至最低，因为所需的操作更少。
一步RT-PCR的主要问题之一是逆转录酶对PCR步骤的抑制作用，与两步RT-PCR相比，这可能导致CT值增加，从而降低灵敏度和特异性。

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在多重实时PCR中，在同一反应中同时定量几个基因组DNA靶标。多重实时RT-PCR是一种类似的方法，可以同时定量同一反应中的几个RNA靶点。

多重PCR和RT-PCR为基因表达分析、病毒载量监测和基因分型等应用提供了许多优势。靶基因和内部对照在同一反应中共同扩增，消除了如果进行单独的扩增反应会发生的井间变异。内部对照可以是在不同样品之间表达不变化的内源性基因(例如，管家基因；见表管家基因通常用作内源性参考)或外源核酸。对于病毒载量监测，使用外源核酸作为内部控制可以检查以下参数：样品制备的成功、抑制剂的缺乏和PCR的成功。多重分析确保了相对基因定量的高精度，其中靶基因的量被标准化为对照参考基因的量。在单个反应中对多个基因进行定量也降低了试剂成本，保存了宝贵的样品材料，并允许增加产量。

多重PCR和RT-PCR通过使用序列特异性探针而成为可能，所述探针各自用不同的荧光染料和适当的猝灭剂部分标记。这意味着染料的发射最大值必须被清楚地分离，并且不能彼此重叠。此外，反应必须在支持多重分析的适当实时循环仪上进行(即，在同一孔或管中激发和检测几种不重叠的染料)。

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绝对定量确定靶标的绝对量(以拷贝数或浓度表示)，而相对定量作为分析的第一步，确定靶标的量与对照(例如，内源性参考分子，通常是合适的管家基因)的量之间的比率。随后，可以使用该归一化值来比较例如不同样本中的差异基因表达。