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使用外部标准可以将基因的水平作为绝对拷贝数给出。对于基因表达分析，最准确的标准是已知拷贝数或浓度的RNA分子。根据靶标的序列和结构以及逆转录的效率，RNA样本中只有一部分靶标RNA会被逆转录。逆转录过程中产生的cDNA然后在随后的实时PCR中用作模板。RNA标准品的使用考虑了逆转录的可变效率。
使用至少5种不同浓度的标准品的稀释系列生成标准曲线(不同标准稀释液的CT值/交叉点与标准量对数的关系图)(见图绝对定量)。未知目标的数量应在测试范围内。标准稀释系列和目标序列的扩增在单独的井中进行。确定标准样品的CT值。然后，将未知样本的CT值与标准曲线进行比较，以确定未知样本中的目标量。重要的是为要量化的核酸类型选择合适的标准。用作标准的核酸的拷贝数或浓度必须是已知的。此外，标准应具有以下特点：
与待定量靶标相同的引物和探针结合位点
与靶序列相同或高度相似的引物结合位点之间的序列
与“天然”靶标相同或相似的扩增序列的上游和下游序列
标准分子和靶分子的等效放大效率
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实验步骤
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用于绝对定量的RNA标准品
RNA标准可以通过将感兴趣的转录物的部分或全部克隆到标准克隆载体中来创建。插入物可以通过RT-PCR从总RNA或mRNA产生，或者通过PCR从cDNA产生。克隆载体必须含有RNA聚合酶启动子，如T7、SP6或T3。确保插入物的体外转录导致有益转录物的产生。在体外转录后，质粒DNA必须用不含RNase的DNase完全去除，因为残留的质粒DNA将导致RNA浓度分光光度测定的错误，并且在随后的PCR中也将作为模板。此外，通过检查RNA在凝胶或毛细管电泳中是否作为单一条带迁移，确保用作标准的RNA不包含任何降解产物或异常转录物。
通过分光光度法测定RNA浓度后，可以使用以下公式计算标准RNA分子的拷贝数：
（X g/µl RNA/[以核苷酸为单位的转录长度*340]）* 6.022 * 1023=Y分子/µl
使用体外转录物作为RNA标准品的替代方案是使用定义的RNA制剂(例如，来自细胞系或病毒制剂)，其靶标的绝对浓度已经确定。 -
用于绝对定量的DNA标准
质粒DNA：创建DNA标准的最方便方法是将PCR产物克隆到标准载体中。这种方法的优点是可以产生大量的标准品，可以通过测序验证其身份，并且可以很容易地通过分光光度法对DNA进行定量。质粒标准品应在靶序列的上游或下游线性化，而不是使用超螺旋质粒进行扩增。这是因为线性化质粒的扩增效率通常与超螺旋构象的扩增效率不同，并且更接近地模拟基因组DNA或cDNA的扩增效率。
在分光光度法测定质粒DNA浓度后，可以使用以下公式计算标准DNA分子的拷贝数：
（X g/µl DNA/[碱基对中的质粒长度* 660]）* 6.022 * 1023=Y分子/µl
PCR片段：含有靶序列的PCR产物也可以用作DNA标准品。我们建议在扩增子的引物结合位点的上游和下游包括至少20bp。拷贝数是使用质粒DNA的公式计算的(见上文)，将“质粒长度”替换为PCR产物的长度。
基因组DNA：如果感兴趣的靶标仅存在于每个单倍体基因组的1个拷贝中，并且可以排除假基因和/或密切相关序列的扩增，那么基因组DNA也可以用作绝对定量的DNA标准。如果生物体的基因组大小已知，则可以直接计算基因组DNA中存在的靶标的拷贝数。例如，Mus musculus的基因组大小（单倍体）为2.7×109bp，分子量为1.78×1012道尔顿。
1.78 x 1012g基因组DNA对应于6.022 x 1023拷贝的单拷贝基因。
1µg基因组DNA相当于一个单拷贝基因的3.4 x 105个拷贝。