7.3.3 PCR中常见关键词与FAQ

扩增曲线：根据荧光信号相对于循环数而制作的曲线，一条良好的扩增曲线具有以下特点：基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势；指数期斜率与扩增效率成正比。

基线：PCR起始时，荧光信号还未发生变化的几个循环。

Ct(阈值循环)：荧光信号超过NTC(无模板对照样品)固定阈值时的循环数 。用于对扩增质量进行验证。

Rn(均一化报告基团)：报告基团染料释放的荧光强度除以惰性参比染料释放的荧光强度。

Rn+：一次反映的Rn值包含所有的组分，包括模板。

Rn-：未反应样品的Rn值。

ΔRn(delta Rn)：在特定PCR条件设置下所产生的信号量级。

ΔRn可通过以下公式计算：(Rn+)–(Rn-)标准品 具有已知浓度的A样本，用于绘制标准曲线。通过使用不同浓度的标准品，您可构建用于未知样品定量分析的标准曲线。

阈值：早期PCR循环时Rn值的平均标准差，乘以相应的校正系数阈值应当设定在PCR指数扩增时的相关区域。

溶解曲线：熔解曲线(Melting curve)是指随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。(仅染料法有熔解曲线)

1.CT值过大，如CT＞30 
(1)模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。
(2)qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。
(3)扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或通过优化引物，扩增产物长度最好不超过300bp。
(4)体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

2. 扩增曲线不光滑
(1)仪器长时间未校准，在检测中出现了波动；或RNA模板不纯。建议定期校准仪器，建议增大模板稀释倍数或者重新制备较高纯度的RNA模板。
(2)若平台期抖动，可考虑仪器与管材不匹配导致的信号采集产生波动。建议尝试更换仪器重新实验。

3.扩增曲线无法到达平台期
基因丰度低、循环数较少，建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。

4.复孔的重复性差
(1)加样误差导致，建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。
(2)模板量低，建议提高模板量，使Ct值落在15-30之间。
(3)仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

1.无熔解曲线
可能是熔解程序设置错误，未搜集荧光信号，建议重新实验，增加熔解曲线阶段的信号搜集。

2.熔解曲线多峰，杂峰Tm在80℃之后
(1)引物特异性过差导致非特异性产物扩增，建议Blast检查引物特异性或重新设计引物。
(2)gDNA污染，可通过NRC进行确认。若NRC有Ct值，可重新制备模板。

3.熔解曲线单峰但不尖锐
可能存在大小相近的非特异性产物，建议进行高分辨率琼脂糖电泳确认。

4.熔解曲线单峰但Tm值在80℃以前
推测未加模板，仅有引物二聚体的扩增。进行高分辨率琼脂糖电泳确认产物或重复试验。

5.熔解曲线峰型杂乱
(1)反应体系污染，结合NTC和NRC结果确认污染情况，建议从水，引物，酶和环境等逐一排除污染。
(2)试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效，建议用新的试剂做对比实验。
(3)仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。
(4)耗材与仪器不匹配，需确认对应仪器对耗材的要求。