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数字聚合酶链式反应(dPCR)是一种通过结合极限稀释、终点聚合酶链式反应和泊松统计对核酸浓度进行绝对定量的方法。
在数字PCR过程中，数字PCR机器将由模板核酸、引物、探针、核苷酸、酶和缓冲液组成的PCR反应分成数千个微反应。每个分区有效地不包含任何、一个或几个靶核酸分子。数字PCR仪器分别放大微反应。在扩增过程结束时，使用荧光探针来检测每个分区中是否存在产物。与模板核酸的阳性反应将发出荧光信号(开)，没有靶核酸的阴性反应将保持暗(关)。
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在分析了阳性和阴性反应的数量后，可以使用泊松统计计算样本中存在的分子的“绝对”数量。与qPCR不同，dPCR不依赖于核酸定量的标准曲线。数字PCR的精确性使其非常适合在复杂背景下检测罕见事件。
实验步骤
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数字PCR简史
数字PCR分析已经存在了30多年，但最近数字PCR系统和化学的改进使这项技术真正蓬勃发展。PCR数字化历史上有哪些里程碑？
1988年：首次描述了数字PCR的概念。
1999年：dPCR方法得到进一步发展；第一项创造“数字PCR”一词的研究发表。
2006/2007：发布了第一个基于微流控芯片和微阵列的商业dPCR系统。
2010年：推出了第一台使用旋转微流体盘的商用dPCR机器。
2011年：推出首款基于水－油乳液/液滴的商用dPCR仪器。
2013年：推出首台基于微板的dPCR商用机器。
2020年：发布首个基于纳米板的dPCR商业系统。
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数字PCR中的泊松统计
在数字PCR分析中，泊松模型用于根据以下公式确定微反映接收零、一、两三、四或五个拷贝的目标分子的概率：
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如上图所示，对于像λ=0.1这样的低浓度，大多数分区将包含目标分子的零拷贝，而几乎所有的正分区将只包含一个目标分子的拷贝。对于λ=0.5这样的中等浓度，一些正分区可能包含一个以上的靶分子拷贝。对于更高的浓度，如λ=5，大多数正分区将包含一个以上的靶分子拷贝，几乎没有分区包含零个靶分子拷贝。
通过一个例子来说明泊松统计在数字PCR分析中是如何工作的：
将5µL DNA样品与3µL母料和4µL引物混合，总dPCR反应为12µL。运行数字PCR系统后，您可以量化8000个有效分区中的4000个阳性分区。
数字PCR工作流程
以基于纳米板的数字PCR为例：
1.准备并加载数字PCR仪器
测量DNA的数量和纯度
通过定义dPCR参数来设置数字PCR系统，如启动、循环、成像剖面、反应混合物、样品、控制和平板布局
在预备中准备反应混合物
用移液管将制备的反应混合物放入纳米板中
箔片密封和手动轧制
小心地将板固定在侧边或通过托盘运输，使反应混合物停留在输入井的底部
装载板并启动数字PCR机器
2.运行和放大
板材在预处理/轧制模块中进行处理，每个井的反应混合物被划分为一千个小的单独反应。
在热循环仪上进行PCR
单个分区内模板材料的存在会导致在成像过程中检测到荧光信号。图像在数字PCR仪器的软件套件中进行处理。
3.分析dPCR结果
根据您的dPCR系统，选择您的应用程序以查看热图、直方图、1D散点图、2D散点图
使用选项更改阈值设置并根据新设置重新计算结果。