4.2 qPCR引物设计

qPCR的一个关键因素是选择合适的引物以获得最大的效率和特异性。

引物特异性受到许多因素的影响，包括序列、引物位置和所使用的qPCR系统。聚合酶链式反应的一般引物设计规则也适用于qPCR，以避免错误定序和引物－二聚体的形成(见聚合酶链式反应引物设计)。这些作用在qPCR中更为明显，逆转录过程中产生的cDNA由于其单链性质更容易受到非特异性启动的影响。qPCR中的非特异性启动降低了该过程的敏感性，导致特异性产物的产量降低或qPCR完全失败。

为了避免扩增污染的基因组DNA，qPCR引物的设计应使引物的一半与一个外显子的3'端杂交，另一半与相邻外显子(见图qPCR引物设计)的5'端杂交。这样的引物将与由剪接的信使核糖核酸合成的cDNA退火，但不会与基因组DNA退火；

为了检测污染DNA的扩增，qPCR引物应设计为位于包含至少一个内含子的区域的侧翼。从cDNA(无内含子)扩增的产物将小于从基因组DNA(含内含子)中扩增的产物。如果只知道信使核糖核酸序列，则选择间隔至少300–400个碱基的引物退火位点。真核生物DNA中这种大小的片段很可能含有剪接连接。如前一点所述，这样的引物可以用于检测DNA污染；

总之，在设计qPCR引物时应考虑以下因素：
退火温度会影响qPCR的效率和灵敏度。
高浓度的引物会导致错误的定序和引物－二聚体的形成。
严格的热启动对于优化qPCR性能至关重要。
qPCR中的引物设计可以区分来自RNA和污染DNA的信号。为了获得最佳结果，应使用不含DNA的RNA，以避免qPCR中DNA的竞争。

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