蛋白互作的意义
蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)在生物分子过程和细胞信号传导中发挥着至关重要的作用，不仅揭示了生物分子的功能和生物过程的调控机制，还为识别潜在的药物靶点提供了可能。蛋白互作方法有很多，比较经典的技术包括：pull-down、Co-IP、酵母双杂交、HTRF；此外还有一些生物物理方法：表面等离子共振分析（SPR）—BIAcore、等温滴定量热法（ITC）、生物膜干涉（BLI）、微量热泳动（MST）、核磁共振分析（NMP）。最近发展起来的一项新兴PPI检测技术——邻近连接技术（Proximity Ligation Assay：PLA），因其高灵敏度和高特异性等优点，也备受关注。
几类PPI检测技术比较
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Pull-down
原理：使用带亲和标签的目的蛋白在体外验证蛋白互作
优点 缺点 • 可以检测蛋白之间的直接相互作用
• 用于体外转录或翻译体系
• 适用于高通量实验
• 无需仪器
• 需要选择合适的亲和标记
• 终点技术
• 实验结果不一定准确
• 低灵敏度
• 只能检测强相互作用
• 只能定性分析
• 不能检测瞬时相互作用
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Co-IP
原理：利用抗体特异性反应在体外研究蛋白互作
优点 缺点 • 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态
• 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物
• 能够对间接相互作用的蛋白进行捕获
• 无需仪器
• 需要特异性的抗体
• 终点技术
• 不能判断直接互作还是间接互作
• 低灵敏度
• 只能检测强相互作用
• 只能定性分析
• 不能检测瞬时相互作用
• 假阳性结果
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酵母双杂交
原理：根据转录调控的特点直接于酵母细胞内检测蛋白互作
优点 缺点 • 无需标记
• 无需纯化蛋白
• 活细胞内进行，具有真实性
• 对瞬时存在的和不稳定的蛋白有较好的检测效果
• 敏感度高
• 适用性广
• 无需仪器
• 假阳性
• 假阴性
• 蛋白表达时可能对酵母产生一定的毒性作用
• 终点技术
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HTRF
原理：利用两个荧光基团彼此接近时传递能量，从而达到检测蛋白互作的目的
优点 缺点 • 灵敏度高，实验通量高
• 步骤简单，无需包被和洗板，无需避光
• 降低背景和提高信噪比
• 适用于小分子和大分子复合物的互作
• 适用于低到高亲和力的相互作用
• 可批量进行实验
• 荧光标记
• 需要使用特殊的荧光显微镜
• 终点技术
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PLA
原理：使用两种抗体识别不同蛋白质既可显示位置又可对蛋白质相互作用进行定量
优点 缺点 • 可视化蛋白互作检测技术
• 目标蛋白的存在信号放大（信号强度增强）
• 可检测含量极低的蛋白质互作
• 灵敏度高、特异性强
• 不受显微镜分辨率的影响
• 终点技术
• 需要标记
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BIAcore
原理：利用表面等离子共振现象模拟分子间的相互作用
优点 缺点 • 无需标记
• 超高灵敏度
• 实验结果重复性好
• 可实现有机溶剂在线背景扣除
• 假阳性低
• 实时观测
• 高通量
• 蛋白用量少
• 可获得亲和力、动力学、浓度等数据
• 需要仪器
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ITC
原理：利用功率补偿原理，测量两个溶液相互作用时吸收或放出的热量来提供分子相互作用的信息
优点 缺点 • 能够在单个实验中确定多个热力学结合参数
• 对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势
• 样品用量小，灵敏度高且精确度高
• 可测的亲和力范围从10-2 M～10-12 M
• 实验时间较短，且操作简单（高自动化）
• 无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰
• 测量时不需要制成透明溶液
• 不破坏样品结构，量热实验完毕，还可以进行后续生化分析
• 需要仪器
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BLI
原理：一种无标记的光学生物传感技术，用于实时监测分析生物分子相互作用
优点 缺点 • 无需标记
• 对生物分子进行准确定量以及对生物分子动力学、亲和力进行实时分析
• 样本用量少
• 对样本纯度要求不高， 粗制样品即可用于检测
• 可以实现多样品同时检测
• 需要仪器
• 要将配体固定到尖端表面
• 灵敏度较低（检测灵敏度比BIAcore低100倍）
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MST
原理：基于检测在温度梯度中的生物分子电泳迁移率的变化而检测生物分子互作
优点 缺点 • 不用固定样品
• 样品用量少
• 可在多种生物溶液中进行检测
• 实时获取检测数据
• 灵敏度高
• 检测时间短
• 荧光标记
• 需要仪器
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NMP
原理：利用核磁性原子的磁共振现象来研究分子相互作用
优点 缺点 • 能够对蛋白质二级结构变化准确测定
• 同位素标记
• 需要仪器
• 只能分析单一组分的蛋白质—配体复合物
• 耗样量大
• 灵敏度低