2.1 免疫共沉淀（Co-IP）

1) 培养的细胞或组织样品
2) 培养基
3) 磷酸盐缓冲液 (PBS)
4) 蛋白酶抑制剂
5) 细胞裂解液
6) Protein A 或 G 琼脂糖珠或磁珠（针对非偶联的一抗）
7) 固定的链霉亲和素（偶联珠子）（针对生物素化抗体）：(#3419) 轻柔涡旋振荡小瓶，并在每次免疫沉淀法中使用 10 µL
8) 磁力架（针对磁珠法）
9) 蛋白靶点的特异抗体  
10) 对照抗体
11) 洗涤和洗脱液
12) 免疫印迹的试剂
13) 激酶缓冲液（激酶测定）：
14) ATP (10 mM) （激酶测定）：(#9804) 要制备 0.5 mL 的 ATP (200 µM)，将 10 µL ATP (10 mM) 加入到 490 µL 1X 激酶缓冲液中。

1) 吸干培养基，添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2) 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
3) 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4) 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5) 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。
6) 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。
7) 对细胞裂解物进行BCA浓度测试。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

对于非接合和生物素化抗体，强烈建议进行细胞裂解物预澄清步骤，以减少与蛋白A或G的非特异性蛋白结合或者内源性生物素的非特异性吸附。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。
方法①：琼脂糖珠法
1) 向浓度为1 mg/mL 的200μL细胞裂解物中添加 20μL蛋白 A 或蛋白G琼脂糖 50% 珠浆，进行非特异性蛋白吸附；或者添加 10μL Streptavidin (Sepharose® Bead Conjugate ) 进行内源性生物素的非特异性吸附。    
2) 在 4°C 下，旋转孵育 30-60 分钟。
3) 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
4) 根据所使用的一抗，继续下述免疫沉淀步骤。
方法②：磁珠法
1) 稍微涡旋母液试管，以重悬磁珠。
2) 重要事项：使用前，预洗涤蛋白 A、蛋白 G或Streptavidin磁珠。转移20μL珠浆到一根干净的试管中。将试管放在磁分离架上 10-15 秒钟。一旦溶液变澄清，便小心清除缓冲液。添加 500μL 1X细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中，稍微涡旋以洗涤珠子。将试管放回磁分离架。一旦溶液变澄清，便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。
3) 添加1 mg/mL 的200μL细胞裂解物到20μL预先洗涤的磁珠中。
4) 在室温下旋转孵育 20 分钟。
5) 使用一个磁分离架将珠子与裂解物分离，并将预澄清的裂解物转移到一根干净的试管中，随后去除磁珠沉淀物。
5) 根据所使用的一抗，继续下述免疫沉淀步骤。

根据所使用的一抗情形，进行实验。
重要事项：强烈建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。
a. Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗
b. Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗
c. Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗
d. Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗
e. Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗
f. Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。
同型对照的浓度应匹配，并与一抗样品同时进行。

情形①： 使用非偶联的一抗（琼脂糖珠法）
1) 将一抗（按产品数据表中建议的合适稀释比例）添加到 200 µL 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。
2) 添加蛋白 A或蛋白 琼脂糖珠（20 µL 50% 珠浆）。轻轻摇动，并在 4°C 下孵育 1-3 小时。
3) 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µL 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
4) 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（2.3.45部分）。

情形②：使用非偶联的一抗（磁珠法）
1) 将一抗（按产品数据表中建议的合适稀释比例）添加到 200 µL 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜，从而形成免疫复合物。
2) 预先洗涤磁珠（参见细胞裂解物预澄清部分，方法②）。
3) 将裂解物和抗体（免疫复合物）溶液转移到一根含有已洗涤磁珠沉淀物的试管中。
4) 在室温下旋转孵育 20 分钟。
5) 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。用 500 µL 的 1X 细胞裂解缓冲液，同时洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
6) 在 20-40μL 1X SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍稍微量离心来让样品沉淀。
7) 将样品加热到 95–100°C，并持续5分钟。
8) 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。将上清液转移到新试管。上清液为样品。
9) 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（2.3.45部分）。

情形③： 使用生物素化一抗(琼脂糖珠法)
1) 将生物素化抗体（按产品数据表中建议的合适稀释比例）添加到 200 µL 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。
2) 轻柔混匀固定化的 Streptavidin (Sepharose® Bead Conjugate )，并加入 10 µl 珠浆。轻柔震荡下，在 4°C 孵育 2 小时。
3) 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µL 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
4) 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（2.3.45部分）。

情形④：④ 使用固定化的抗体 (琼脂糖珠偶联)
1) 轻轻混合，并添加固定的微珠接合物 (10 µL) 到浓度为 1 mg/ml 的 200 µL 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。
2) 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µL 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
3) 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（2.3.45部分）。

情形⑤：⑤ 使用固定化的抗体 (磁珠偶联)
1) 轻轻混合，并加入偶联固定化的珠子 (10 µL) 到浓度为 1 mg/ml 的 200 µL 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。
2) 将试管放在磁性分离架上使磁珠沉淀，并等待 1 - 2 分钟，直至溶液变得澄清。用 500 µL 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
3) 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（2.3.45部分）。

(1)  方法① 用蛋白免疫印迹法进行分析
1) 在 20-40 µL 1XSDS 样品缓冲液中重悬沉淀物。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
2) 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。
3) 将样品 (15-30 µL) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。
4) 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。
注：对于分子量接近 50 kDa 的蛋白，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (HRP Conjugate)(#93702) 或Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) (#5127)作为二抗，以将变性重链产生的遮盖作用减到最小。对于分子量接近 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) (#5127)。

(2)   方法② 用激酶活性测定法进行分析
1) 用 500 µL 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
2) 在 40 µL 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
3) 30°C 条件下孵育 30 分钟。
4) 用 20 µL 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
5) 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
6) 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。
7) 将样品 (15-30 µL) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。