名词解释
Input组:即未经IP的细胞裂解物,判断目标蛋白表达情况和富集相对程度。
阴性对照组:与一抗相同来源的阴性对照抗体,作为蛋白与IgG结合的背景信号。
阳性对照组:已知有相互作用的两个蛋白作为阳性对照。
实验步骤
- 1
- 2
案例一
目的:用Anti-Y免疫沉淀Y蛋白,IP后WB用Anti-X验证X与Y是否有相互作用
Input:细胞裂解液
阴性对照:IgG△点击放大图片
结果:
Input泳道有X、Y的条带,说明细胞中X和Y蛋白表达成功
IgG为阴性对照,泳道无条带
Anti-X泳道,用X的抗体检测IP后的复合物,说明Y能富集X蛋白
综上,X与Y有相互作用案例二
目的:研究β-catenin和FBXW2的互作
Input:全细胞裂解液(WCE)
IP:HA,表明是用HA标记的蛋白作为诱饵蛋白,使用HA抗体(anti-HA)作为诱饵蛋白抗体进行IP实验
阴性对照:Vector
阳性对照:已知β-TrCP1与β-catenin有相互作用,用β-TrCP1做阳性对照△点击放大图片
样本描述:本轮实验有5组样本,从左至右分别标注为1-5
样本1:表达β-catenin-WT,带Flag标签以及空载
样本2:表达β-catenin-WT,带Flag标签,同时表达FBXW2,带HA标签
样本3:表达β-catenin-WT,带Flag标签,同时表达β-TrCP1,带HA标签
样本4:表达β-catenin-WT,带Flag标签,同时表达FBXW7,带HA标签
样本5:表达β-catenin-WT,带Flag标签,同时表达SKP2,带HA标签
WB结果
全细胞裂解液(WCE)
样本1:Flag-β-catenin-WT表达成功,其他蛋白不表达
样本2:Flag-β-catenin-WT及HA-FBXW2表达成功
样本3:Flag-β-catenin-WT及HA-β-TrCP1表达成功
样本4:Flag-β-catenin-WT及HA-FBXW7表达成功
样本5:Flag-β-catenin-WT及HA-SKP2表达成功
IP: HA的WB结果
(使用HA抗体作为诱饵蛋白抗体进行IP实验,对IP产物做WB)
用HA抗体做WB,5个样本均有条带
用Flag-β-catenin做WB,只有样本2、3有条带,说明样本2、3的IP产物里有Flag-β-catenin蛋白。
综上,β-catenin与FBXW2和β-TrCP1有相互作用