4.3 基于Biacore的蛋白-蛋白互作—案例分析

Biacore助力VEGF-B机制研究
VEGF-B prevents excessive angiogenesis by inhibiting FGF2/FGFR1 pathway
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41392-023-01539-9
(1)文章概述：
虽然很久以前就发现了血管内皮生长因子-B（VEGF-B）是VEGF-A的同源物，但其对血管生成的作用仍知之甚少。尽管如此，VEGF-B和其他血管内皮生长因子家族成员的药物正被用于治疗各种新生血管疾病患者。因此，更好地了解VEGF-B的血管生成作用及其潜在机制至关重要。利用体外和体内综合的方法和模型，作者首次揭示了当FGF2/FGFR1途径大量表达时，VEGF-B作为内源性血管生成抑制因子通过抑制FGF2/FGFR1途径发挥的意外和令人惊讶的功能。VEGF-B与FGFR1结合，诱导FGFR1/VEGFR1复合体的形成，抑制FGF2诱导的ERK活化，抑制FGF2诱导的血管生成和肿瘤生长。
(2)实验目的：
通过前期的研究积累，研究人员首先怀疑VEGF-B能够与FGFR1互作，FGFR1可能是潜在的新受体。作者使用Biacore检测VEGF-B和FGFR1间的相互作用，以及VEGF-B、FGF2和FGFR1之间，是否存在受体竞争关系。
(3)实验步骤：
使用Biacore 8K系统检测VEGF-B与FGFR1的结合。使用氨基偶联试剂盒将VEGF-B蛋白固定在CM5芯片上，使其达到5389响应信号(RU)。加入梯度稀释的FGFR1-FC(12.5、25、50、100、200和400 nM)流经芯片表面(30 ul/min)。使用10 mM甘氨酸(pH 1.5和2.0)处理60s，在两次检测之间再生芯片表面。使用Biacore软件使用1：1结合模型对数据结果进行分析，得到动力学和亲和力参数。
为了检测VEGF-B是否与FGF2竞争FGFR1结合，使用氨基偶联试剂盒将VEGF-B蛋白固定在CM5芯片上，使其达到6900响应信号(RU)。分别加入FGFR1-Fc(200 nM)与6.25 nM的BSA、FGF2或PIGF分别流经芯片表面(10 ul/min)。
(4)实验结果：
VEGF-B与FGFR1的结合：
表面等离子体共振(SPR)分析表明，VEGF-B与FGFR1结合的Kd值与FGF2相似(VEGF-B为17 nM，FGF2为16 nM，图a，b)，而血管内皮生长因子家族中的另一个VEGFR1结合成员—胎盘生长因子(PlGF)没有结合(图C)，表明VEGF-B与FGFR1的结合是特异的。
 

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VEGF-B、FGF2和FGFR1之间受体竞争关系检测：
由于VEGF-B和FGF2都与FGFR1结合，作者继续探讨它们是否对于与FGFR1结合相互竞争。SPR分析表明FGF2与VEGF-B竞争FGFR1结合，而PIGF不与VEGF-B竞争。
 

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Biacore助力新冠病毒研究
Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation
原文链接：https://www.science.org/doi/full/10.1126/science.abb2507?rfr_dat=cr_pub++0pubmed&url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori%3Arid%3Acrossref.org
（1）文章概述：一种新型冠状病毒(2019-nCoV)的爆发代表了一种已被宣布为国际关注的突发公共卫生事件的大流行威胁。CoV spike(S)是疫苗、治疗性抗体和诊断的关键靶点。为了便于医学对策的开发，作者确定了2019-nCoV S三聚体的3.5埃分辨率的冷冻电子显微镜结构。三聚体的主要状态是三个受体结合域(RBD)中的一个向上旋转，形成可接纳受体的构象。作者还提供了生物物理和结构证据表明，2019-nCoV S蛋白与血管紧张素转换酶2(ACE2)结合的亲和力高于SARS-CoV S。此外，作者还测试了几种已发表的SARS-CoV RBD特异性单抗，发现它们与2019-NCoV S没有明显的结合，这表明两种RBD之间的抗体交叉反应可能是有限的。
（2）实验目的：2019-nCoV S和SARS-CoV S拥有相同的功能宿主细胞受体-血管紧张素转换酶2(ACE2)，因此，作者用Biacore分别检测了2019-nCoV和SARS-CoV的Spike蛋白与ACE2的结合亲和力和动力学特征，以比较这两种病毒对宿主细胞受体结合的差异，从而了解2019-nCoV侵染细胞的机制。
（3）实验步骤：
使用Biacore X100和由10 mM HEPES pH 8.0、150 mM NaCl和0.05% Tween 20组成的运行缓冲液将His标记的2019-nCoV S蛋白固定在NTA传感器芯片上，使其达到~800个响应单位(RU)的水平。加入纯化的和未标记的ACE2的系列稀释液，浓度范围为250到15.6 nM。使用Biacore评估软件使用1：1结合模型对数据结果进行分析。使用Biacore X100和上面相同运行缓冲液将His标记的SARS-CoV RBD-SD1固定在NTA传感器芯片上，使其达到~350RU的水平。加入纯化的和未标记的ACE2的系列稀释液，浓度范围从500到31.3 nM。使用Biacore软件使用1：1结合模型对数据结果进行分析。
（4）实验结果：
ACE2以~14.7 nM的亲和力结合到2019-nCoV S的胞外结构域，比SARS-CoV S与ACE2结合高约10~20倍。和SARS-CoV相比，2019-nCoV S与ACE2结合的解离速度更慢。
 

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