5.1 邻近连接技术 (PLA)

Proximity Ligation Assay（简称：PLA）叫邻近连接技术，是看得见的蛋白互作新技术，即便是微量样本、微弱或者瞬时的互作以及低丰度的表达，也能在内源水平可视化目的蛋白的互作、定位和定量。并且该技术可将蛋白信号放大千倍，灵敏度高、特异性好。不仅如此，该技术操作简单，用时短，仅需一天即可得到结果。 

当一对 Navenibodies 与蛋白质靶标近距离结合时，它们共轭的寡核苷酸可通过酶连接使另一对寡核苷酸环化。环化的 DNA 链与 Navenibodies 保持杂交，其中一个寡核苷酸作为引物进行局部滚圆扩增（RCA）反应。通过适当标记的检测探针，可检测到扩增后的 DNA 形成明亮的荧光点或显色点。

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①封闭样本
②一抗孵育：两种一抗分别与位于一种蛋白质或两种邻近蛋白质上的目标表位结合
③Navenibody孵育：Navenibodies（与专有寡核苷酸臂结合的精选抗体）与各自的一抗结合。
④DNA circle形成：当 Navenibodies 足够靠近时，附着的寡聚物能形成 DNA circle，通过减少非特异性背景染色来保证高特异性（如果两个蛋白有相互作用，就会使两个探针之间距离缩短，产生了所谓的邻近效应（proximity））。
⑤扩增和检测：加入聚合酶后，就会启动滚圆扩增反应，标记的探针与扩增的DNA结合，显色形成亮点，该信号可使用显色剂或荧光进行检测，并分别通过明视野或荧光显微镜进行评估。