5.2.1 Naveni® PD1/PD-L1 AP

1. 抗原修复后，加入足够的碱性磷酸酶/辣根过氧化物酶封闭液(用于猝灭)以覆盖每个样本，根据厂家的用户指南进行孵化；
2. 用1x TBS-T清洗载玻片2x5分钟；
3. 准备两瓶1X TBS-T，将一瓶预热至37℃，并预热所需数量的染色瓶。

1. 在每 40 µL 封闭缓冲液（1x）中加入 5 µL 补充剂 1，配制封闭溶液（表1）；
2. 封闭液加入整个样品区域，每 1 平方厘米区域约 40 微升；
3. 在 37 °C 的预热湿盒中培养 60 分钟。

1. 在每 40 µL 抗体稀释液（1x）中加入 5 µL 补充剂 2，制备一抗溶液（表 1）；
2. 用配制的一抗溶液将 PD1 和 PD-L1 抗体稀释至 1 倍（各稀释 1:40）；
3. 倒掉玻片上的封闭液，用 1x TBS-T 冲洗 2x 3 分钟；
4. 加入足够的稀释抗体以覆盖样本区域；
5. 在 37 °C 下孵育 60 分钟，或在 4 °C湿盒中孵育过夜。
6. 倒出抗体溶液，在染色瓶中用 1x TBS-T 冲洗玻片 3x 5 分钟。

表1：封闭溶液和一抗溶液
△点击放大图片

1. 将 Navenibody M1 和 Navenibody R2 以 1:40 的比例稀释在 Navenibody 稀释液（1x）中；
2. 加入足量的 Navenibody 工作溶液，以覆盖样品区域；
3. 在预热的湿盒中 37 °C孵育 60 分钟；
4. 倒掉NaveniBody溶液；
5. 用染色瓶中预热的 1x TBS-T 清洗切片 2 次，每次 10 秒，每次 15 分钟；单独清洗对照组。

1. 用蒸馏水以 1:5 稀释缓冲液 1，涡旋混匀；
2. 在稀释缓冲液中加入酶1，稀释比为 1:40，制备反应 1。用移液器轻轻混合，然后涡旋混匀；
3. 加入足够体积的反应 1 以覆盖样品区域；
4. 在 37 °C 的预热湿盒中孵育 30 分钟；
5. 在染色瓶中用 1x TBS-T 冲洗玻片 2x 3 分钟。

1. 用蒸馏水以 1:5 稀释缓冲液 2，涡旋混匀；
2. 在稀释缓冲液中加入酶 2 ，稀释比为1:40，制备反应 2。用移液器轻轻混合，然后涡旋混匀；
3. 加入足够体积的反应 2 以覆盖样品区域；
4. 在预热的湿盒中 37 °C 下孵育 90 分钟。

1. 倒出溶液，在 1x TBS 中清洗玻片 2x 5 分钟，然后在染色瓶中的 0.1x TBS 中清洗 1x 10 分钟；
2. 用 AP 稀释液按 1:300 稀释 AP 试剂；
3. 从玻片中倒掉洗涤缓冲液；
4. 加入足量的 AP 溶液以覆盖样品区域；
5. 室温下在摇床上缓慢搅拌培养 30 分钟。

1. 倒出溶液，在染色瓶中用 1x TBS 冲洗玻片 2x 2 分钟；
2. 将 AP 底物1（稀释 62.5 倍）和 AP 底物 2（稀释 80 倍）在 AP底物稀释剂中混合，制备底物溶液；

表2：最小反应体积的计算
△点击放大图片

3. 从玻片中倒掉洗涤缓冲液；
4. 加入第一份底物溶液，覆盖样品区域；
5. 将载玻片与底物在室温下孵育 25 分钟；
6. 倒出载玻片上的底物溶液，用去离子水清洗载玻片 2x 2 分钟。

1. 从载玻片中倒掉洗涤缓冲液；
2. 加入足够的核染色剂以覆盖样本区域；
3. 室温下孵育 2 至 10 秒钟；
4. 用流动的自来水（非去离子水）冲洗玻片。

1. 用水清洗玻片 5 分钟；
2. 用异丙醇清洗玻片 2 次，每次 1 分钟，快速脱水；
3. 擦去玻片上多余的异丙醇，涂上 VectaMount® Express 基底承载液 (H-5700-60)；
4. 盖上盖玻片，让载玻片在室温下晾干 10 至 20 分钟；
5. 使用明亮视野的显微镜进行分析，至少使用 20 倍物镜；
6. 成像后，在室温下保存玻片，信号可稳定数年。