5.3 邻近连接技术 (PLA)—FAQ

纳文抗体是一种与寡核苷酸序列结合的抗体（二抗），也称为 "邻近探针"。当两个 Navenibodies 非常接近时，寡核苷酸可以将添加的一对寡核苷酸模板化，开始滚圆扩增（RCA）反应，从而产生一个强烈而明显的点。

如果您的抗体需要不同的固定条件，您可能需要优先考虑使用哪种抗体的最佳要求。在扩大实验规模之前，对不同条件进行小规模测试比较可能会有所帮助。

福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片通常使用两种主要的抗原检索方法：  热诱导表位检索（HIER）和蛋白水解诱导表位检索（PIER）。这两种方法与所有纳维尼产品兼容。对于 HIER，可能需要优化溶液的 pH 值。
用于抗原检索的缓冲液和酶举例：
HIER：10 mM 柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0；1 mM 乙二胺四乙酸，pH 8.0；Tris-EDTA，pH 9.0；Trilogy™ 三部曲。
PIER：蛋白酶 K、胃蛋白酶、胰蛋白酶
细胞膜的渗透稳定化可使抗体、寡核苷酸和酶等大分子进入细胞，为细胞内表位提供通道。优化渗透剂的类型以及每次实验的暴露时间至关重要。

Naveni® 原位邻近连接技术产品为蛋白质亚细胞位置、蛋白质相互作用和蛋白质修饰提供了可视化的可能性，前提是两个目标表位之间的距离在 40 nm 以内。

Naveni®技术经过开发和优化，可用于固定细胞和组织。

为确保成功，在进行 NaveniFlex 或 NaveniBright 检测前，必须仔细选择抗体，并优化包括样品固定、抗原回收、阻断和抗体稀释等参数，以确保最佳的抗体结合。

一抗应为 IgG 类，对目标蛋白具有特异性，最好是亲和纯抗体。它们可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在进行 NaveniFlex 或 NaveniBright 检测前，一定要通过 IF/IHC 验证抗体。

A.确保抗体适合所选应用
B.了解用于生产抗体的免疫原序列（表位）--为实现双重识别，表位不得重叠。如果可能，一定要针对目标蛋白使用一对以上的抗体，以增加成功几率。
C.对于新抗体，选择抗体检测规格以降低成本。许多供应商都提供这种选择。
抗体种类：抗体种类应适合所选的 NaveniFlex 或 NaveniBright 试剂盒：
MR 试剂盒需要一种小鼠抗体和一种兔抗体
GM 需要一种山羊抗体和一种小鼠抗体
GR 需要一种兔抗体和一种山羊抗体。

第一抗体浓度是任何免疫测定的基本决定因素。应通过滴定来确定每种抗体的最佳稀释度，以产生最多的分离信号，同时将背景保持在最低水平。
首先使用之前 IF 或 IHC 实验中的抗体浓度（如适用），或抗体数据表中推荐的浓度。在阳性和阴性对照上进行抗体滴定。

我们的二抗是在驴体内培养的。

不，使用来自同一物种的两种抗体无法检测蛋白质的相互作用、修饰或同源二聚体。

Naveni® 产品具有荧光读取功能，可发出斑点状信号，只要相关蛋白质含量不过高，每个斑点都可作为独立对象进行计数。我们建议通过测量每个独立通道中每个细胞的强度进行量化，或对斑点状信号进行对象分割和计数。细胞数量可以通过识别细胞核的数量来计算，因此不要忘记按照试剂盒说明书的建议加入核染色剂。

目前，我们的试剂盒只能用于小鼠、兔子或山羊的一抗。不过，由于大鼠和小鼠关系密切，针对小鼠一抗的纳文抗体可能会与大鼠抗体产生一定程度的交叉反应。如果您的一抗在免疫荧光试验中能与抗小鼠二抗一起使用，那么它也应该能与我们的试剂盒一起使用。不过，这必须针对每种特定抗体进行测试。

Naveni® 产品并不适合用于全装片组织。如果您想对整个装片进行染色，则需要调整方案。我们建议将每次孵育时间延长 50%。可能还需要增加酶的浓度。

蛋白靶标结合特异性可能因阻断和抗体稀释所用的缓冲液而异。试剂盒中提供的 NaveniFlex Cell 封闭液和抗体/探针溶液已针对 NaveniFlex Cell 检测进行了优化，可与大多数抗体兼容。不过，在进行 NaveniFlex Cell 实验前，应先用免疫荧光染色验证抗体性能。如果 NaveniFlex Cell 阻断溶液导致特定抗体的信号强度明显降低或背景增加，请查看产品说明书，了解有关适用阻断剂和抗体稀释剂的建议。

Naveni® 原位近接检测会产生直径约 500 nm 的明显圆形信号，至少使用 20 倍物镜（有时可能需要 40 倍）才能观察到这些信号。

使用 NaveniFlex Cell，您可以检测蛋白质相互作用、分析内源性蛋白质、研究蛋白质修饰，并可对固定细胞进行相对定量。所有 NaveniFlex Cell 产品都基于二抗系统，能高灵敏、特异性地读出所选靶标。您应根据您的一抗种类和首选的信号检测滤光片组来选择使用哪种试剂盒。
①根据抗体种类： 如果您使用的是小鼠和兔的一抗，请选择 NaveniFlex Cell MR。处理山羊和小鼠一抗时，使用 NaveniFlex Cell GM；处理兔和山羊一抗时，使用 NaveniFlex Cell GR。
②根据荧光显微镜的滤光片设置：选择 NaveniFlex Cell RED（使用 Cy3.5 滤光片可检测荧光染料）（Abs max: 595 nm, Exc max: 627）和 NaveniFlex Cell Atto647N（使用 Cy 5 滤光片可检测荧光染料）（Abs max: 649 nm; Exc max 662 nm）。

NaveniFlex Tissue 经 FFPE 和新鲜冷冻人和小鼠组织切片验证。该产品已在多种类型的健康组织和癌症组织（如结肠、扁桃体、卵巢、肾脏、乳腺、脾脏、大脑和皮肤）上进行了验证。

试剂盒包括三种不同的染料，Naveni® TriFlex Cell 检测的信号类型各一种。要观察兔抗体信号，请使用激发波长在 480-490 纳米范围内、发射波长在 525-535 纳米范围内的滤光片组。要观察小鼠抗体信号，请使用激发波长为 545-555 nm、发射波长为 575-585 nm 的滤光片。若要观察近距离信号，请使用激发波长为 635-645 nm、发射波长为 665-675 nm 的滤光片组。

我们不建议将非人类细胞系或组织与 Naveni® PTM 试剂盒一起使用。试剂盒中的抗体不会与人类以外的物种发生交叉反应。

开发的试剂盒可用于固定细胞。任何通常用于 IHC 或 IF 等其他免疫染色方法的细胞都可用于 Naveni® PTM 检测。