实验原理
构建“诱饵蛋白”X常用的标签是GST、HIS和MBP，以GST为例：基于GST（glutathione-S-transferase），即谷胱甘肽-S-转移酶蛋白，可以与谷胱甘肽（Glutathione，GSH）结合。将GSH固定于琼脂糖珠/磁珠上，形成GSH-琼脂糖珠/磁珠，将已知蛋白X与GST融合表达，获得的GST-X可与GSH-琼脂糖珠/磁珠结合，若环境中存在与X蛋白互做的蛋白Y，则会形成“琼脂糖珠/磁珠-GSH-GST-X-Y”复合物，与X蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。（常用的标签是GST、HIS和MBP，此处以GST为例）。
亲和固化在GSH琼脂糖珠/磁珠上的X蛋白成为“诱饵蛋白”，“捕获蛋白”Y即为目的蛋白。
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视频素材来源于YouTube https://www.youtube.com/watch?v=6yIO_8VF5xk
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实验步骤
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样本处理
情形1：对于大肠杆菌表达系统：
①每5mL原始培养液离心弃上清后，加入200μL冰冷TBS重悬，用移液管或涡旋混合器混合，离心弃上清；
②向上述沉淀中，加入200μL Pull-Down裂解缓冲液，此过程中可加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解；需要注意的是，部分Pull-Down裂解缓冲液不具备去除包涵体的作用，如需溶解包涵体，需额外添加相关试剂；
③冰上裂解30 分钟，定期翻转试管；
④12,000×g离心5分钟，取上清即可，做好标记。情形2：对于昆虫表达系统：
①将昆虫细胞培养物转移到无菌离心管中，以500×g离心5分钟，弃去培养上清液；
②每5mL培养的昆虫细胞加入1mL冰冷的TBS。倒转试管数次，使细胞彻底悬浮；
③以500×g离心5分钟，弃去培养上清液；
④每克昆虫细胞团的湿重加入2.5体积的Pull-Down裂解缓冲液，并立即倒置直至彻底混合，此过程可使用蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解；
⑤冰上裂解30 分钟，定期翻转试管；
⑥12,000×g离心5分钟，取上清即可，做好标记。情形3：对于哺乳动物细胞表达系统（胞内表达蛋白）：
①每2ml细胞培养体系使用1mL TBS清洗细胞，加入200μL Pull-Down裂解缓冲液，可加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解；
②冰上裂解10 min，12,000×g离心5分钟，取上清即可，做好标记。
“诱饵蛋白”X和“捕获蛋白”Y根据不同的表达体系按照上述方法制备，分别做好标记为X裂解液、Y裂解液。 -
固定诱饵蛋白X
1)平衡谷胱甘肽磁珠：磁珠的使用量是由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得。如通过预实验估算其目标蛋白产量为5~10 mg，磁珠的蛋白结合量为10mg/mL，则1mL X裂解液需加入1ml磁珠。取适量磁珠使用平衡液进行溶液环境的置换；
2)混合X裂解液：将X裂解液加入磁珠中，盖紧离心管盖；注意，需保留足够的X裂解液以便于后续的SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;
3)孵育：将离心管置于漩涡混匀器振荡15 s，然后置于旋转混合仪上，室温旋转混合20~30 min（如果需要，可在2~8℃的低温环境下旋转混合约1 h，防止目标蛋白降解）；
4)分离：将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液到新的离心管中以备后续检测；
5)清洗：加入适量的洗涤缓冲液清洗磁珠，旋转混合2 min，磁性分离，移出清洗液到新的离心管中，以备取样检测，重复洗涤两次。 -
捕获“捕获蛋白”Y
1)混合Y裂解液：向上述固定好的诱饵蛋白X及磁珠中加入适量捕获蛋白Y裂解液，注意也需保留足够的Y裂解液以便于后续的SDS-PAGE分析蛋白的表达;
2)孵育：置于旋转混合仪，于4°C孵育至少1小时；
3)分离：将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液到新的离心管中以备后续检测；
4)清洗：加入适量的洗涤缓冲液清洗磁珠，旋转混合2 min，磁性分离； -
洗脱诱饵蛋白X捕获和捕获蛋白Y复合物
1)制备洗脱液：制备10mM 谷胱甘肽洗脱缓冲液，还原型谷胱甘肽容易被氧化，注意按需溶解，防止氧化，请勿一次性全部溶解，并且添加谷胱甘肽会改变缓冲液的pH值。使用前需将洗脱缓冲液的最终pH值调至8.0。
2)洗脱：加入适量洗脱缓冲液，置于涡旋仪5min-10min；
3)离心：1200xg离心1min，收集洗脱液，进行后续分析。 -
蛋白质鉴定
将洗脱下来的蛋白XY复合物进行Western blot、质谱等分析。