在设计引物时，我们需要在引物的两端添加酶切位点，以用于之后扩增片段的酶切。为了保证基因序列的方向性，并且防止自连，现在基本上都选择双酶切位点。
酶切位点的选择原则：
1）酶切位点存在于载体上，不存在于基因序列中；
2）两个酶最好有共同的缓冲体系；
3）两个酶在载体上酶切位点位置不能太近。
以下以Primer 5软件为例，对确定酶切位点进行介绍。
实验步骤
- 1
- 2
- 3
-
输入CDS序列
打开Primer 5，选择file - new -DNAsequence，输入上述保存的CDS序列，点击As Is；
△点击放大图片
-
选择想要使用的内切酶
点击左侧Enzyme框，看一下载体上选择的双酶切位点是否在右侧框中，如果不在，从左侧框中添加到右侧框中；
△点击放大图片
-
查看选择的内切酶是否在基因序列中
点击OK即可查看CDS序列中有无选定的酶切位点，如果选定的双酶切位点存在于目的蛋白的CDS序列中，需重新选择双酶切位点。
△点击放大图片