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拿到合成的引物之后,我们就可以进行目的基因的扩增了。合成目的基因通常是以目标物种的基因组为模板。
由于真核生物的基因组中存在内含子序列,在mRNA的剪接加工过程中被切除,因此,在构建真核基因克隆时基因组DNA不能直接用作PCR扩增的模板,只能从细胞或者组织中提取总RNA或者mRNA,反转录cDNA作为模板通过PCR扩增目的基因。
实验步骤
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加Trizol,静置
从细胞培养箱中取出已经长满细胞的细胞培养皿,小心吸出培养基,加入4ml预冷PBS,倾斜细胞培养皿3次以充分洗涤细胞,然后小心吸尽PBS溶液。
培养皿中加入1ml Trizol试剂裂解细胞,冰上静置5min,枪头吹打,室温静置5min;加氯仿,离心
将细胞裂解液吸到1.5ml EP管中,加入氯仿0.2 ml,震荡仪震荡15s。
室温静置2-3min,12000xg,4℃,15min离心。分层取上层
离心后液体分为三层(上层无色为RNA,中层为DNA,底层为蛋白质),小心吸取上层无色液体至新的EP管中。
加异丙醇,离心
加入等体积异丙醇,混匀,冰上静置10min,12000xg,4℃,10min离心。
此时在管底可见RNA白色沉淀,弃去上清。加乙醇,离心,干燥
加入75%乙醇1ml,震荡仪震荡30s,7500xg,4℃,5min离心。
小心去上清,管 内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。加DEPC水溶解
加入20ul DEPC水溶解。水浴或者加热器55-60℃,10-15min。
测纯度和浓度
测定纯度和浓度。吸光度A260/280比值接近2表明纯度较高。