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1.1.5 从细胞中提取总RNA

| 1.1.6 反转录+PCR扩增

视频素材来源于YouTube  https://www.youtube.com/watch?v=RmPsLoIPRwc
版权归原作者所有

拿到合成的引物之后,我们就可以进行目的基因的扩增了。合成目的基因通常是以目标物种的基因组为模板。
由于真核生物的基因组中存在内含子序列,在mRNA剪接加工过程中被切除,因此,在构建真核基因克隆时基因组DNA不能直接用作PCR扩增的模板,只能从细胞或者组织中提取总RNA或者mRNA,反转录cDNA作为模板通过PCR扩增目的基因。

实验步骤

  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 5
  • 6
  • 7
  • 1

    加Trizol,静置

    从细胞培养箱中取出已经长满细胞的细胞培养皿,小心吸出培养基,加入4ml预冷PBS,倾斜细胞培养皿3次以充分洗涤细胞,然后小心吸尽PBS溶液。
    培养皿中加入1ml Trizol试剂裂解细胞,冰上静置5min,枪头吹打,室温静置5min

  • 2

    加氯仿,离心

    将细胞裂解液吸到1.5ml EP管中,加入氯仿0.2 ml,震荡仪震荡15s
    室温静置2-3min12000xg4℃15min离心。

  • 3

    分层取上层

    离心后液体分为三层(上层无色为RNA,中层为DNA,底层为蛋白质),小心吸取上层无色液体至新的EP管中。

  • 4

    加异丙醇,离心

    加入等体积异丙醇,混匀,冰上静置10min12000xg4℃10min离心。
    此时在管底可见RNA白色沉淀,弃去上清。

  • 5

    加乙醇,离心,干燥

    加入75%乙醇1ml,震荡仪震荡30s7500xg4℃5min离心。
    小心去上清,管 内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min

  • 6

    加DEPC水溶解

    加入20ul DEPC水溶解。水浴或者加热器55-60℃10-15min

  • 7

    测纯度和浓度

    测定纯度和浓度。吸光度A260/280比值接近2表明纯度较高。

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