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目的基因扩增之后,就要将目的基因和表达载体连接在一起。通常使用酶切连接的方法,将目的基因和表达载体分别用同样的两个限制性内切酶进行双酶切,得到互补的酶切位点,然后用T4连接酶将这两部分连接在一起。
酶切操作建议参考购买的限制性内切酶的使用说明书,这里介绍常规方法。
实验步骤
- 1
- 2
- 3
配置反应体系
在两个PCR管中分别混合以下成分:
表达载体酶切 表达载体 2ug 10x缓冲液 5ul 酶1 1ul 酶2 1ul ddH2O 补齐至30ul PCR产物酶切 目的片段 43ul 10x缓冲液 5ul 酶1 1ul 酶2 1ul PCR仪或者水浴进行酶切
轻弹管壁混匀,短暂离心。
放入PCR仪中,37℃,3h。或者37℃水浴进行孵育。跑电泳并进行胶回收
跑电泳并进行胶回收