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目的基因与载体的连接反应中,存在多种可能的连接方式,除了正确连接外,也可能出现载体和载体连接,目的基因和目的基因连接,或者部分连接的情况,因此需要把正确连接的重组质粒筛选出来。通常将连接产物转化到大肠杆菌中,通过菌落PCR或者酶切鉴定的方法筛选出阳性克隆株,然后送到测序公司进行测序。测序准确的阳性克隆株就可以进行大量扩增和保存。
常用的大肠杆菌感受态细胞为DH5α或者TOP10。
实验步骤
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融化感受态大肠杆菌
取出感受态大肠杆菌,放于冰上使其慢慢融化。
加连接产物,孵育
将连接产物加入100ul感受态大肠杆菌中,轻轻混匀,冰上孵育30分钟。
热激,冷激
将EP管放入42℃水浴箱中热激90秒,再迅速放于冰上2分钟。
加培养基
EP管中加入400ul LB培养基,置于摇床上,37℃,500rpm培养45分钟。