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酶切鉴定需要提质粒,如果直接送公司测序,此步也可省略。提取质粒一般也是使用试剂盒进行操作,这里参照爱必信的质粒小量快速提取试剂盒产品说明书进行介绍。
产品组份:
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实验步骤
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吸附柱平衡
向吸附柱AC 中(吸附柱放入收集管中)加 500μl 的平衡液 BL,12,000rpm 离心1min, 倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
离心收集菌体
取 1.5-4.5 ml过夜培养的菌液 12,000rpm 离心 30sec,尽可能的倒干上清,收集菌体。
加入溶液P1,P2,P3,离心
用 250μl 溶液 P1 重悬菌体沉淀,涡旋振荡至彻底悬浮。
加 250μl 溶液 P2,温和地上下翻转 4 -7 次(裂解时间不超过 5min)使菌体充分裂解。
加 350μl 溶液 P3,立即温和地上下翻转 4 -7 次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀,12,000rpm 离心 5 min。加入过滤柱,离心
将上清加入到过滤柱E中(过滤柱放入 1.5ml或2ml离心管中),12,000rpm离心2min,
收集液体。如上清量较大,请分两次离心。加入吸附柱,离心
将上述液体转入吸附柱 AC 中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm 离心 30-60 sec,倒掉管中的废液。
可选步骤: 所用菌株为 JM 系列、HB101 等 endA 菌株或野生型菌株时,由于核酸酶含量丰富, 应加入 500μl 去蛋白液 PD,12,000rpm 离心 30-60 sec,弃废液。加入漂洗液WB
加入 500μl 漂洗液 WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心 30-60sec 弃掉废液。
重复上个步骤。离心收集
将吸附柱 AC 放回空收集管中,12,000rpm 离心 2 min,将吸附柱置于室温放置数min,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
加洗脱缓冲液EB
取出吸附柱 AC,放入一个干净的离心管中,室温放几分钟。
在吸附膜的中间部位加 50μl-100μl 洗脱缓冲液 EB(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置 2 min,12,000rpm 离心 1 min。如果需要较多量质粒,
可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心 1 min。(注意:若用 ddH2O 做洗脱液,应保证其 pH 值在 7.0-8.5 范围内,pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于 50 μl,体积过小影响回收效率。且 DNA 产物应保存在-20℃,以防DNA 降解。)测序
鉴定后的阳性克隆株进行培养,送公司测序。测序成功的菌株进行培养和保存。