2.3 跑胶鉴定

大肠杆菌菌体通过离心收集（16,000g for 3 min），菌体沉淀用裂解液进行悬浮（100 μl of 50 mM Tris–HCl buffer, pH 8.0, containing 200 mM NaCl, 2% Triton X-100 and 3 mM protease inhibitor PMSF），然后冰上超声20次（sonicated 3 s with 7 s intervals between each pulse）。

超声后的菌体进行离心（16,000g for 15 min at 4℃），取部分上清和6xloading buffer混合，在95℃加热5min，瞬离。

拿出电泳仪的制胶架，干净的玻璃板，夹紧玻璃板。先配制下层的分离胶。
用烧杯或者锥形瓶按照以下配方进行配制。

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摇匀，用移液枪缓慢加入玻璃板中，注意尽量不要产生气泡。用1ml无水乙醇或者蒸馏水，压在分离胶上面。

待分离胶凝固后，倒出上层的无水乙醇或者水，用滤纸吸干。按照以下配方配制上层浓缩胶。

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摇匀，用移液枪缓慢加入玻璃板中，注意尽量不要产生气泡。插入梳子。

把制备好的凝胶从制胶架上取下来，放入电泳槽中。电泳槽加入电泳缓冲液。取部分样品和6xloading buffer混合，在95℃加热5min。拔出胶上的梳子，把样品加到梳孔中。在旁边的孔中加上蛋白Marker。
电泳缓冲液配方：

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盖上电泳仪盖子，插上电源。可以先用80V跑胶，当样品跑入分离胶后，可用220V跑胶。溴酚蓝跑到比较靠下的位置，停止跑胶。

可用考马斯亮蓝R250进行凝胶染色。这里以爱必信的考马斯亮蓝R250产品说明进行介绍。
（1）电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。
（2）置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色 1h 或更长时间。
注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。
（3）倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少 2-3 次。
（4）加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。
（5）置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色 4-24h。期间更换脱色液 2-4 次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色 1-2h 后即可出现。
注：脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。

完成脱色后，进行观察和拍照。