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凝胶过滤层析主要用于精细纯化或者去除多聚体。凝胶过滤层析主要根据上样量和蛋白分子量进行选择。
这里以Superdex 200 Increase 10/300为例进行介绍。
实验步骤
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缓冲液的选择
缓冲液可以根据您的样品或者下游应用进行选择，由于在极低盐浓度的情况下，酸性和碱性蛋白质都可能发生离子相互作用，因此推荐的缓冲液是 0.01 至 0.05 M 磷酸钠再加上0.15 M NaCl，pH 7.4。
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样品处理
Superdex 200的分离范围为10KD-600KD
上样体积：25-500ul，如果样品量太大可用超滤浓缩管对样品进行浓缩。
蛋白浓度：样品中最多50 mg/mL，在低于10 mg/mL时可获得更高的分辨率。
准备：将样品溶解在缓冲液中，10000 g 离心10 分钟，用0.22 μm 过滤器过滤。 -
设置报警压
根据层析柱的耐压在系统中设置柱前压和delta压。Superdex 200的柱前报警压为0.5Mpa，delta报警压为0.3Mpa。
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连接预装柱
系统设置一个低流速， 移除预装柱顶部的堵头，把柱子连接到 ӒKTA 纯化仪的接头上，
注意要液滴对液滴进行连接，防止引入气泡。
去除柱子底部的堵头，连接到纯化仪上。 -
层析柱平衡
以0.75 mL/min 的流速使用至少 2 个柱体积 (CV) 的室温去离子水进行平衡。
以0.75 mL/min 的流速用至少 2 个柱体积 (CV) 缓冲液平衡层析柱。 -
样品上样及洗脱
以0.75 mL/min 的流速进行上样和缓冲液洗脱。按照固定体积或者峰值进行样品收集。
纯化结束后，用2CV的缓冲液清洗柱子，然后填充20%乙醇。拧上柱子上下的堵头，防止柱子变干。 -
跑胶鉴定
跑胶鉴定