逻辑设门方案
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生物学背景
Treg backbone多色方案是一种8色流式方案，设计用于识别CD3+CD4+CD25+CD127low/- Tregs的主要亚群。该多色方案能够对初始和记忆性/效应Tregs进行特性研究，后者可进一步细分为CD15s+高度分化Tregs和CD161+炎性细胞因子生产Tregs。
为了对Tregs进行更深入的特性研究，我们在这里展示了两个4色可选方案。活化Tregs可选方案包括活化标志物PI-16、HLA-DR、CD147和CD39。Th样Treg亚群可选方案包括趋化因子受体CXCR3、CCR4、CCR6和CCR10，用于识别Th1-、Th2-、Th17-和Th22-样Treg亚群。
实验步骤
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配色方案
激光
标志物 荧光染料 克隆 体积/测试 货号 Violet 405 nm CD15s BV510 CSLEX1 5 µL 563529 CD45RA BV605 HI100 5 µL 562886 CD161 BV711 DX12 5 µL 563865 CD127 BV786 HIL-7R-M21 5 µL 563324 Blue
488 nmViability 7-AAD N/A 5 µl 559925 CD25 PE-CyTM7 2A3 5 µL 335789 Red
640 nmCD3 Alexa Fluor® 700 UCHT1 0.6 µL 557943 CD4 APC-H7 RPA-T4 5 µL 560158 Drop-Ins—Activated Tregs
激光 标志物 荧光染料 克隆 体积/测试 货号 Violet 405 nm PI-16 BV421 CRCBT-02-001 0.6µL 744829 Blue
488 nmCD147 FITC HIM6 20µL 555962 HLA-DR PE G46-6 20µL 555812 Red 640 nm CD39 APC TU66 20µL 560239 Drop-Ins—Th-Like Treg Subsets
激光 标志物 荧光染料 克隆 体积/测试 货号 Violet 405 nm CD183 (CXCR3) BV421 1C6/CXCR3 5µL 562558 Blue
488 nmCD196 (CCR6) BB515 11A9 5µL 564479 CD194 (CCR4) PE 1G1 5µL 551120 Red 640 nm CCR10 APC 1B5 0.15µL 564771 -
逻辑设门图&数据结果说明
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使用Treg backbone多色方案和额外的可选方案对人调节性T细胞进行特性研究
从健康人中分离的PBMC 的代表性分析。A）使用8 色Treg backbone 多色方案识别Treg 亚群。首先根据光散射特性和7-AAD + 死细胞排除法识别活淋巴细胞（未显示）。通过活淋巴细胞门，首先对CD3 + CD4 + T 细胞设门，然后识别CD25 + CD127 low /− Tregs。Tregs 可进一步分为CD45RA + 初始和CD45RA−记忆性/效应Tregs。通过记忆性/效应Tregs 门，识别了CD15s + 高度活化Tregs 和CD161 + 炎性细胞因子生产Tregs 的离散亚群。B）使用四个插入物扩展backbone 多色方案，以测量Treg 活化标志物的表达（PI-16、CD147、HLA-DR、CD39）。检测结果与预期一致：相较于初始Tregs（蓝色，顶部直方图），在记忆性/效应Tregs（红色，底部直方图）中观察到了这些标志物的更高表达。C）使用四个插入物扩展backbone多色方案，根据趋化因子受体CXCR3、CCR4、CCR6和CCR10 的差异表达，识别效应Tregs 的Th 样亚群。在3 激光12 色BD FACSLyric 流式细胞仪上获取样本。使用FlowJov10软件分析数据。