2.1 Single-cell Suspensions from Mouse brain tissue

产品名称	产品编号
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons	130-094-802
gentleMACS C Tubes	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	130-096-427
Rotator Mix	130-090-753
70um细胞过滤器（200目，白色）	abs7008
100um细胞过滤器（160目，黄色）	abs7009
MACS Tissue Storage Solution组织保存液	130-100-008

 

1、 提前准备
· 无二价阳离子Ca²⁺或Mg²⁺的Hanks缓冲盐溶液(HBSS(w/o))
· HBSS，标准，即Ca²⁺和Mg²⁺(HBSS(w))

 

2、 根据后续应用中感兴趣的抗原表位，使用基于木瓜蛋白酶的神经组织分离试剂盒(P)或基于胰蛋白酶的神经组织分离试剂盒(T)

 

3、 从神经组织分离试剂盒中准备以下溶液
· 溶液2:加入β-巯基乙醇至0.067mM
· 溶液4:将粉末溶解于0.7ml缓冲液中(试剂盒中提供)，轻轻混合
· 酶混合物1:将1.9ml溶液2和50μl溶液1(均来自试剂盒)移液到C管中，在37°C下孵育10-15分钟。这足以解离400mg的脑组织
注意事项：为了无菌，建议在层流罩中进行。使用C管和优化、预设的gentleMACS程序实现单细胞悬液的标准化制备。

1.在含有1mlHBSS(w/o)的管中称脑组织；

2.将小鼠大脑转入含有预热酶Mix 1的1950μl C管中。(注:本方案适用于≤400mg，但溶液体积可缩放至每C管可容纳高达1600mg脑组织)；

3.将C管放在gentleMACS解离器上，运行程序“m_brain_01”；

4.在37°C下旋转孵育15分钟(使用MACSmix Tube Rotator，每分钟4rpm)；

5.将C管放在gentleMACS解离器上，运行程序“m_brain_02”；

6.在分离步骤中，将20μl溶液3和10μl溶液4轻轻混合，每400mg组织制备30μl酶混合物2；

7.将酶混合物2通过隔膜密封帽加入C管，轻轻混合；

8.在培养箱中37°C旋转培养C管10分钟；

9.将C管放在gentleMACS解离器上，运行程序“m_brain_03”；

10.在培养箱中37°C旋转培养C管10分钟；

11.简单地离心以收集试管底部的样品。

 

GentleMACS全自动处理流程：https://m.bilibili.com/video/BV1YX4y127tv?vd_source=0ff41d41cad8b86a12b6cda29ad9a086

1.选择一个足够大的过滤器，以允许通过感兴趣的细胞；

2.使用合适的1000μl移液器通过隔膜密封帽从C管中除去细胞，并将其应用于15ml收集管上的预分离过滤器；(注:对于较大的样本量使用50ml收集管)；

3.用10mlHBSS(w)清洗过滤器；

4.过滤后的细胞在室温下以300xg离心10分钟；

5.将上清液重悬在所选的培养基或缓冲液中，以便后续应用；

6.要去除髓磷脂碎片，使用Myelin Removal Beads。

 

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使用gentleMACS Dissociator进行大脑分离可产生97%的活细胞；

 

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在添加了MACS Supplement B27 PLUS的MACS^®NeuroMedium中培养7天后，使用Anti-Prominin-1 MicroBeads磁细胞分选后神经球形成的光学显微镜照片。使用神经组织分离试剂盒(Neural Tissue Dissociation Kit, P)从CD1小鼠大脑(P3)制备细胞；

 

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单细胞悬浮液中的髓磷脂碎片严重损害细胞分离，而髓磷脂去除珠去除髓磷脂碎片可提高细胞分离效率。对于使用Anti-Prominin-1 MicroBeads的MACS分离，使用神经组织分离试剂盒(P)分离P22小鼠大脑。单细胞悬浮液中的细胞要么直接用于分离，要么使用髓鞘去除珠进行髓鞘去除。将未去除髓鞘和去除髓鞘的样品进行分离比较，结果表明，去除髓鞘的样品纯度更高。