实验步骤
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制备流程
1.请记录用于流式细胞术的心脏组织的重量;
2.将心脏组织样本转移到一个60毫米的培养皿中,用PBS冲洗;
3.将心脏纵向解剖成两半,再次用PBS冲洗,然后转移到一个干净的60毫米培养皿中。将500μl的组织消化试剂混合物注入心脏组织;Reagent Final concentration Amount Collagenase II (10,000 U/ml) 400 U/ml 200 μl DNase I (2U/μl) 48 U/ml 120 μl DMEM n/a 4.68 ml Total n/a 5 ml 4.通过多点注射,将混合试剂均匀地分散到整个组织中;
5.将剩下的4.5ml的组织消化试剂混合物倒入含有心脏组织的培养皿中;
6.在37℃下孵育10min,80rpm轻轻摇晃10min;
7.将心脏组织取出(例如,培养皿盖),用手术刀切切,直到大约0.5-1毫米3大小;
8.将消化后的心脏组织重新悬浮在消化混合物中,然后转移到一个50ml的试管中;
9.在37℃下孵育30min,150rpm振荡,以防止组织沉淀;
10.通过一个70μm的过滤器,用一个3ml的注射器柱塞的橡胶端轻轻地粉碎任何剩余的团块;
11.用10ml DMEM和15% HI-NCS冲洗细胞过滤器;
12.在21-23℃温度下300g离心3min去除碎片颗粒,然后小心地取出并丢弃上清液;
13.在1ml 42% percoll,转移到新的15ml管中;
14.在21-23℃温度条件下800g离心20min,无刹车,分离实质细胞(顶层)和白细胞(颗粒);
15.小心地完全去除并丢弃顶部的细胞层和上清液;
16.将样本重悬于100μl的RBC裂解液中,15ml试管中加入900μl的RBC裂解缓冲液;17.在室温条件下孵育2min,直到红细胞被裂解。
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