5.1 Single-cell suspensions from Mouse Kidney

Collagenase stock solution (10,000 U/mL stock) (worthingon,LS0004189) 

 

DNase I stock solution (20 mg/mL stock) (LS002139) 
Dissolve DNase I in cell culture water to reach a fifinal concentration of 20 mg/mL.

 

Digestion solution 
Prepare a 2× Master mix of Col IV and DNase I in RPMI without FCS and without other additives. A total of 1 mL of  2× master mix is required for each kidney (total digestion volume is 2 mL). For the 2× master mix, a 1:25 dilution of the collagenase stock solution and make a 1:50 dilution of the DNase I stock solution to reach a concentration of 400 U/mL Col IV and 0.4 mg/mL DNase I in the required volume of RPMI.

 

FACS buffer 
PBS containing 1% FCS, 2.5 mM EDTA, and 0.02% sodium azide.

 

10% sodium azide stock solution 
Prepare a mass:volume 1:10 stock of sodium azide by dissolving the required amount of sodium azide in deionized water.

 

Percoll density layers (Cytiva,17089102) 

 

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1.用PBS(使用26G针)对小鼠实施安乐死后立即灌注，以消除血管血液含量。通过添加EDTA或在室温或37°C下使用PBS，可以提高灌注的效果；

2.分离肾脏，通过拉扯器官周围的薄层组织，小心地取出肾包膜。将肾脏放入装有1ml RPMI的Bijou小瓶中，一直放在冰中直到进一步处理；

3.用解剖剪刀将肾脏切成小块(越小越好)；

4.制备2×的Col IV和DNase I在完全培养基中RPMI，不添加添加剂。在所有样品中加入1ml的2×主混合物，最终浓度达到200U/ml Col IV和0.2mg/ml DNAse I。总体积为2ml的消化混合物可用于一个或两个肾脏的消化；

5.在37°C下孵育1小时，同时在摇床中以200-250rpm振荡；

6.准备一个50ml的锥形管和一个100μm的细胞过滤器；

7.1小时后，组织应被充分消化，以便使用P1000移液管和1ml滤移液管头上下移液管；

8.将消化后的溶液转移到放置在50ml锥形管顶部的100μm过滤器上，并使用注射器的柱塞将肾脏研磨通过过滤器。用5ml冰冷的FACS缓冲液洗涤过滤器，洗涤2次；

9.离心，400×g 5min在4°C；

10.将细胞重悬浮在4ml 70% Percoll溶液中，并转移到15ml锥形管中。用4ml 37%的percoll，然后用加1ml 30%的Percoll（如下图）；

 

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11.在室温下900×g离心30min,使用一次性Pasteur移液管去除30%的顶层，丢弃。然后在70%-37%的界面上收集细胞；

12.离心处理细胞，弃用上清液。