8.1 Single-cell Suspensions from Mouse skin

Preparation of digestion solution for whole skin tissue

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FACS buffer (BD,554656)
PBS supplemented with 0.5% BSA (v/v) and 2 mM EDTA

Dispase II (LS02109)
Dissolve the lyophilized Dispase II enzyme in HEPES-buffered  saline (50 mM HEPES/KOH pH 7.4, 150 mM NaCl) to obtain a stock solution of 10 mg/mL

DNase I (LS002139)
Dissolve Deoxyribonuclease I (DNase I) in phosphate buffered saline (PBS) to reach a fifinal concentration of 1 mg/mL

LiberaseTM(Roche,04501020001)
Dissolve the lyophilized LiberaseTM in 1× RPMI Medium without FCS or any other supplements to obtain a stock solution of 5 mg/mL

用颈椎脱位法对小鼠实施安乐死

耳朵位置的皮肤：
1. 剪掉老鼠耳朵上无毛的部分。
2. 用镊子将背侧和腹侧分开。用镊子轻轻地刮擦耳朵的内侧，去除任何剩余的软骨。 

躯干皮肤：
1. 用电动剃须刀和精致的脱毛乳液刮去动物的整个皮肤。
2. 剪下所需的皮肤样本(从2cm²到整个动物的皮肤)。
注意：如果切断小鼠的整个背侧和腹侧皮肤，在小鼠背部的中间垂直切开，然后沿着小鼠身体周围剃光的区域的边界切开。 轻轻地将皮肤与腹膜和背部肌肉分离，用镊子保持皮肤样本静止，同时用手术剪刀或手术刀闭合的圆角尖端分离皮肤样本。
3. 准备一个100mm细胞培养板，包含10ml冰PBS。                         
4. 将皮肤样本浸入步骤1.3.3制备的平板中，用钳子刮除皮肤样本，以消除皮下脂肪。

尾部位置的皮肤：
1. 剪掉鼠尾巴。 
2. 用手术剪刀或手术刀在尾巴上垂直切开，从尾巴底部开始，一直延伸到尾巴的尖端。 
3. 用镊子将皮肤从尾巴上分离出来。抓住尾巴底部的切口边缘，用钳子抓住尾巴的身体，轻轻向尖端拉。
4. 轻轻刮除皮肤样本，去除多余的脂肪。

脚板位置的皮肤:
1. 用手术剪刀把整个鼠脚都剪下来。避免切割任何多毛的皮肤。 
2. 从脚踝到手指的开始，纵向切开脚的皮肤。 
3. 用镊子或手握住踝骨，用钳子抓住皮肤，将皮肤朝向手指，就像取下手套一样。

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1.用细剪刀将组织切成非常小的小块；
2.加入1.8ml的消化溶液；
3.混匀孵育，将其放入一个管摇床(37°C，900rpm，90 min)；
4.在每根试管中加入40μl的0.5M EDTA；
5.涡旋，再孵育10min(37°C，900rpm)；
6.70μm过滤器放在一个50ml的试管上；
7.加入5ml的FACS缓冲液来平衡过滤器；
8.涡旋组织悬浮液，并将每个样品倒入过滤器上；
9.用5ml FACS缓冲液清洗每个过滤器；
10.离心50ml管，过滤器以468×g和4°C离心5min；
11.除去过滤器和上清液(从脂肪层和表面的气泡开始)；
12.使用细胞微球进行进一步的分析。如有必要，在4°C的FACS缓冲液中存储细胞。