10.1 Single-cell Suspensions from Mouse tumor tissue

DNase I （LS002139 ） 
To prepare the 10 mg/mL stock solution, deoxyribonuclease I (DNase I) was dissolved in 100 mL of 5 mM calcium chloride(CaCl₂). Sterile fifilter the solution through a sterile 0.22 μm Stericup and store aliquots at −20°C.

 

Collagenase D （Roche,11088858001） 
The 40 mg/mL stock solution is prepared by dissolving 500 mg collagenase D in 12.5 mL Hank’s balanced salt solution (with Ca²⁺ and Mg²⁺). Sterile fifilter the solution through a sterile 0.22 μm membrane and store aliquots at −20°C.

 

10% BSA/PBS 
Dissolve 50 g of bovine serum albumin (BSA) in 500 mL PBS (can also be heated up to 40°C while stirring) and fifilter it through a 0.22 μm Stericup

 

Accutase (BD,561327)

 

FCR blocking （553141）

 

7-AAD (559925)

 

100um细胞筛网（黄色）（Absin, abs7233)

 

肿瘤样本收集(1h)

· 需要新鲜的肿瘤，必须在收到样本后立即或至少在收到样本后12小时后准备处理样本。
· 将肿瘤样本放入充满无血清RPMI培养基的无菌管中，4℃保存。样品必须完全浸在介质中。

 

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1.在开始之前，用70%的酒精对工作空间和设备(剪刀和镊子)进行消毒

2.在15ml管中准备酶消化混合物:
a.加入4.7ml不含血清和任何其他补充剂的RPMI培养基    

b. 在试管中加入200μl酶H、100μl酶R,  25μl酶A    

c.涡旋混匀

3.将肿瘤切成大约2mm³的小块，直接放入酶混合物中

4.将样品放入37 ℃培养箱连续旋转40min
（注:通常取4~12cm³肿瘤样本。该方案适用于约6cm³的肿瘤样本体积，如果肿瘤大于6cm³，我们建议将肿瘤分成两个混合酶管）

5.将100μm的细胞滤网放在50ml试管上，用1ml培养基冲洗细胞滤网

6.用酶消化培养基将消化的肿瘤块转移到细胞滤网上

7.用1ml注射器柱塞的扁端轻轻粉碎肿瘤(将柱塞从注射器中取出)
a.粉碎肿瘤时，定期用培养基清洗细胞滤网  

b.继续粉碎，直到肿瘤组织的最大解离  

c.清洗细胞过滤器，直到在50ml试管中达到48ml细胞悬浮体积 

8.将细胞悬液以400-500xg离心10分钟

9.离心过程中，准备1X5ml红细胞裂解液

10.弃上清，在试管中保留少量培养基(约500μl)

11.轻拍试管将颗粒轻轻分离

12.用5ml移液管将颗粒与5ml红细胞裂解液缓慢重悬，使之5X上下。

13.在20℃-25℃孵育3分钟

14.将细胞悬液以400-500xg离心5分钟

15.弃上清，重悬于20ml培养基中

16.用台盼蓝液计数细胞数和活力

17.用400-500xg离心细胞悬液5分钟，弃上清，在10ml培养基中重悬颗粒
a.分离总细胞约50-100万，在5ml试管中进行流式染色

18.将细胞悬液以400-500xg离心5分钟，弃上清，进行柱状细胞分离(注意:在以下步骤中，必须用铝箔保护避光)
c.在旋转过程中，用100μl的PBS稀释0.1μl的浓缩原液，制备死活染料        

d.用100μl稀释的死活染料重悬细胞，在20℃- 25℃下孵育25分钟

19.流式细胞术染色时，细胞悬液(总细胞数的50-100万)以400-500xg离心5分钟，丢弃上清液
a.将细胞颗粒重悬于200μl的PBS中
b.细胞悬液400-500xg离心5分钟，弃上清（注意:在以下步骤中，必须用铝箔避光。）
c.在旋转过程中，用100μl的PBS稀释0.1μl的浓缩原液，制备活/死固定蓝活力染色
d.用100ml稀释的活/死固定蓝液重悬细胞颗粒，在20℃-25℃下孵育25分钟
e.在孵育期间，制备抗体混合物
f.加入100μl FACS缓冲液，以400-500xg离心5分钟，弃上清
g.用25μl Fc block(用FACS缓冲液稀释10倍)重悬细胞颗粒。在20℃-25℃孵育10分钟
h.直接在细胞悬液上加入25μl抗体混合物1(concentrated 2x)。冰上孵育25min
i.在试管中加入300μl的FACS缓冲液进行清洗。离心5分钟，400-500xg，弃上清液
j.在使用流式细胞仪分析之前，将细胞重悬于200μl FACS缓冲液中，并在50μm细胞过滤器上过滤细胞悬液
k.使用Flowjo软件进行分析