实验步骤
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所需试剂&耗材
化学品和酶 备注 DMEM基础培养基 用于细胞培养的反相对比显微镜 1×PBS 70μm的细胞过滤器，50 ml锥形管 胎牛血清 培养箱设置为37°C，5%二氧化碳 青霉素和链霉素 5毫升锥形管 台盼蓝 50毫升锥形管 ACK裂解缓冲液 100 mm培养皿 AQIX RS-I“即用型”解决方案 BD FACSAria分选流式细胞仪 FCMase组织消化酶 EasySepTM 胶原酶I（LS004196） 无菌手术器械和准备工具 胶原酶II（LS004177） 胶原酶IV（LS004182） 透明质酸酶（LS002592） DNA酶I（LS002139） PI（abs9105） HypoThermol FRS保存溶液 CS10冷冻保存溶液 -
肾脏处理方法
1.在培养皿中，清除肾组织中粘附的脂肪和外膜；
2.新鲜样品储存在组织保存溶液(AQIX)中；
3.组织块的一部分在HypoThermosol FRS保存溶液中孵育30分钟；
4.补充1ml CS10冷冻保存溶液；
5.在−80°C下储存过夜，然后转移到液氮中；
6.组织块的另一部分放入50毫升离心管中，用穿刺针切成小块，分别称重；
7.获得的样品加入5ml离心管中；
8.3ml PBS洗涤，以300g离心5分钟，然后除去上清液；
9.切割穿孔的样品，并用PBS再次洗涤，丢弃上清液；
10.使用消化酶在37°C下进一步消化粘性细胞团块20分钟；
11.使用DMEM完全培养基停止消化；
12.通过70μm细胞滤网过滤所得细胞悬浮液；
13.以300g离心5分钟，去除上清液；
14.沉淀重悬于DMEM培养基中；FCMase酶浓度
将不同浓度的FCMase(6、7、8和9μl/mg)添加到肾组织样品中，然后在37°C下孵育20分钟。在孵育过程中，每5分钟混合一次样品。
FCMase消化的持续时间
将FCMase消化酶以8μl/mg的浓度添加到肾组织样本中，这意味着将80μl的FCMase添加到一个穿刺组织(10mg)中。随后，将组织样本在37°C下消化10分钟、20分钟和30分钟，并每5分钟混合一次。
胶原酶类型和浓度
通过将126.6、36.2和42.6mg的量分别与15.83、4.53和5.33ml的DMEM高葡萄糖培养基混合，制备8mg/ml的胶原酶I、胶原酶II和胶原酶IV储备溶液。将每种胶原酶以1/8mg/ml的比例添加到肾穿刺样品中，使用以下浓度0.125、0.25、0.5、1、2和4mg/ml，并在37°C下孵育20分钟，同时每5分钟混合一次。
胶原酶组合
使用L9(34)正交表设计了9个胶原酶组合组。所用胶原酶的类型、浓度和配方如表1所示。将DNase I(0.1mg/ml)和透明质酸酶(0.1mg/ml)添加到每个胶原酶组合中，并在37°C下孵育20分钟，每5分钟混合一次。测量细胞计数和活力。使用LiberaseTM和FCMase进行比较。
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操作流程图
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