16.1 Single-cell Suspensions from Human lung tumors

肿瘤可以在4摄氏度下储存在培养基管中长达24小时。

1.开始之前先用70%乙醇消毒；

2.在15ml试管中制备酶消化混合物；
a.添加4.7ml不含血清和任何其他补充剂的RPMI培养基。    

b.向试管中加入200ml酶H、100ml酶R和25ml酶A。    

c.通过涡流充分混合。

3.将肿瘤切成大约2mm³的小块，并将其直接放入酶混合物中；

4.将样品放入37摄氏度的培养箱中，连续旋转40分钟；
注：通常情况下，我们获得4至12cm³的肿瘤样本。该方案适用于约6cm³的肿瘤样本量，如果肿瘤较大，我们建议将其分成两个大于6cm³混合酶管。

5.将100mm的细胞滤网放置在50ml试管上，并用1ml培养基冲洗细胞滤网；

6.将消化的肿瘤块与酶消化培养基一起转移到细胞滤网上；

7.用1ml注射器柱塞的平端轻轻拍打肿瘤；

a.在粉碎肿瘤的过程中，定期用培养基清洗细胞滤网。 

b.继续粉碎，直到最大限度的肿瘤组织分离。    

c.清洗细胞滤网，直到达到48ml的细胞悬浮液

8.将细胞悬浮液在400–500xg下离心10分钟；

9.在离心过程中，制备5ml红细胞(RBC)裂解溶液1X；

10.丢弃上清液，并在试管中保留少量培养基(约500ml)；

11.轻敲试管，轻轻地将颗粒溶解；

12.使用5ml移液管，用5ml红细胞裂解溶液缓慢复苏沉淀，并使其上下移动5倍；

13.在20摄氏度至25摄氏度下培养3分钟；

14.将细胞悬浮液在400–500xg下离心5分钟；

15.丢弃上清液并将沉淀重悬于20ml培养基中；

16.用台盼蓝溶液计数细胞数量和活力；

17.以400–500xg离心细胞悬浮液5分钟，丢弃上清液，重悬于10ml培养基中；

a.在5ml试管中分离约0.5–100万个总细胞进行流式细胞术染色。

18.以400–500xg离心细胞悬浮液5分钟，丢弃上清液，进行柱状细胞分离(见肿瘤驻留记忆T细胞的分离)。

 

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