17.1 Single-cell Suspensions from Human adipose

DNase （LS002139) 

Reagent	Final Concentration (mM or uM)	Amount
Deoxyribonuclease I from Bovine Pancreas	11,100 U/mL	Varies by batch

 

Collagenase Il （LS004176)

Reagent	Final Concentration (mM or uM)	Amount
Collagenase from Clostridium Histolyticum (Type ll)	14,220 U/mL	Varies by batch

 

Wash/Digestion Buffer

Reagent	Final Concentration (mM or uM)	Amount
Fetal Bovine Serum	2%	10 ml

 

Lysis Buffer

Reagent	Final Concentration (mM or uM)	Amount
Lysing Buffer	555899	100ml

 

时间：[20-30分钟]

1.准备一个50ml Falcon管，其中含有20ml洗涤/消化缓冲液，准备转移从外科手术中获得的人体脂肪组织样本。

2.立即将人体脂肪组织样品转移到冰冷的洗涤/消化缓冲液中，并保持在冰上。方案建议的最小脂肪组织为0.15g。
注意：根据收集的脂肪组织类型(如皮下、内脏)，可能存在残余血液。确保用洗涤/消化缓冲液彻底清洗样品。洗涤步骤包括将组织连续(两次)浸入新鲜的洗涤/消化缓冲液中，以去除残留的血液。

3.使用无菌钳子和剪刀，仔细解剖出任何额外的非脂肪组织(如结缔组织、烧灼组织)(图1A)。

4.继续进行消化。
暂停：虽然最好直接进行消化方案，但此时可以将脂肪组织留在冰箱中1-12小时，这比在消化方案期间暂停要好。

 

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在这个步骤中，脂肪组织被处理和消化。这将基质血管部分细胞与细胞外基质分离，同时确保其生存能力。

1.称重脂肪组织，并每克样品加入2ml冰冷的洗涤/消化缓冲液。
注：如果样品<1g，则加入2ml冰冷的洗涤/消化液，并继续进行所有步骤。

2.使用无菌剪刀，将脂肪组织切碎，并每毫升洗涤/消化缓冲液添加200毫升胶原酶II(2844U)和2.5毫升DNase(27.75U)。
关键：在配制胶原酶II和DNase储备溶液时，始终检查批号和相应的酶活性，单位为每毫克，因为这会有所不同。因此，以mg/ml表示酶浓度是不实际的，因为我们必须将其标准化为U/ml。
关键：在这一点上确保所有的脂肪组织都是漂浮的。任何下沉到管道底部的组织都可能是非脂肪组织，应将其移除。
注：将胶原酶II和DNase储备溶液储存在小份中，以最大限度地减少重复冷冻/解冻循环的影响，这将降低酶活性。

3.将样品置于37摄氏度、225转/分的摇瓶培养箱中25–30分钟。
注：挖掘的样品应看起来均匀且呈粉白色，较大的样品可能比较小的样品花费稍长的时间(图B)。

 

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4.通过100mm细胞筛将样品转移到用冰冷的洗涤/消化缓冲液预洗涤的50ml管中。然后用洗涤/消化缓冲液将Falcon试管加满至30ml。
注意：确保用洗涤/消化缓冲液冲洗用于消化的样品管，使剩余的样品和菌株通过相同的100mm细胞筛。

5.在4℃下以800xg离心样品10分钟。
临界：离心后，打开试管，检查样品的漂浮部分是否由透明的脂滴组成。如果你能看到一层白色的脂肪组织漂浮着，那么这层顶层需要用巴斯德移液管去除并重新消化(图C)。2ml洗涤/消化缓冲液中重新消化，使用一半的原始胶原酶体积，即在2ml冲洗/消化缓冲溶液中的200ml胶原酶II，用5mlDNase消化10分钟（如步骤3所示）。这将确保你从每个样本中获得所有可能的基质细胞，特别是巨噬细胞。

6.丢弃上清液，并且剩余的沉淀含有基质血管部分细胞。
注意：如果要使用珠富集(推荐)，则直接进行清洗步骤8，否则进行步骤7中所述的红细胞裂解。

7.可选：将颗粒在500毫升红细胞裂解缓冲液(ACK裂解缓冲液)中再悬浮约1分钟。

8.加满冰冷的洗涤/消化缓冲液，并通过70mm细胞筛将样品转移到用洗涤/消化缓冲剂预洗涤的50ml管中。然后用洗涤/消化缓冲液将试管填充到顶部。

9.在4℃下以800xg离心样品10分钟。

10.丢弃上清液，并且剩余的沉淀包含基质血管部分细胞。

 

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