2.2 抗体对选择及优化

| 2.3 信号特异性

实验步骤

1

蛋白制备

使用缓冲液制备4X初始浓度的蛋白X和Y。蛋白：实验室纯化获得或商业化蛋白，蛋白浓度已知；
2

蛋白稀释

按照最高浓度进行10倍连续稀释(仅包括缓冲液样品)：

PROTEIN X

Tube # Final Concentration 4X Concentration

1 300 nM 1200nM

2 30 nM 120 nM

3 3nM 12 nM

4 OnM 0 nM

PROTEIN X

Tube # Final Concentration 4X Concentration

1 300 nM 1200 nM

2 30 nM 120 nM

3 3nM 12 nM

4 OnM 0 nM

图2：抗体对选择实验蛋白稀释参考
3

加样

以384孔板为例，取微孔板平置于操作台，以5μl/孔加入蛋白X(4X)后，加入蛋白Y(4X)，盖上封板膜(防止样本蒸发)，室温静置，孵育60分钟。

Tips 1：如果没有信号或信号很低，可考虑增加或降低孵育温度将提高信号，而不增加背景。

Tips 2：孵育时间可依据蛋白特性进行优化调整，延长或缩短时间，多数蛋白样本60分钟时间足够。
4

加检测试剂

每孔加入5μl抗标签供体和5μl抗标签供体。(或可将检测试剂预混在一起，后以10μl/孔加入样本中）。盖上封板膜，室温静置，孵育60分钟。

Tips 1：在第一次实验时，可选择在120、180、240分钟和夜间进行多次检测，以获得最佳测检测信号。
5

读板

去掉封板膜，平行放入酶标仪，选择TR-FRET程序进行读值。
6

结果

最好的信噪比，即信号/背景(S/B)，作为蛋白的最佳浓度。

举例：6His-p53蛋白和GST-HDM2蛋白相互作用, anti-GST-d2和anti-6His-Tb Gold获得最佳信噪比，为最佳抗体配对。(如图3)

图3：p53-HDM2案例分析

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PROTEIN X
Tube #	Final Concentration	4X Concentration
1	300 nM	1200nM
2	30 nM	120 nM
3	3nM	12 nM
4	OnM	0 nM