2.3 信号特异性

| 2.4 蛋白浓度优化

实验步骤

1

蛋白制备

使用缓冲液制备5X初始浓度的蛋白X和Y。
2

蛋白稀释

按照最高浓度进行10倍连续稀释(仅包括缓冲液样品)：

PROTEIN X AND PROTEIN Y

Tube # Final Concentration 5X Concentration

1 100 nM 500 nM

2 10 nM 50 nM

3 1 nM 5 nM

4 O nM O nM

图4：特异性信号验证实验蛋白稀释参考
3

蛋白原液制备

在EP管中，制备10X浓度的未标记蛋白。终浓度为实验中使用的标记蛋白浓度的最高浓度的100倍。如制备100µM的原液，最终浓度为10µM(100倍于100 nM)。
4

加样

选择384孔为例，空板中加入未标记蛋白2μl，依次加入5X蛋白X和蛋白Y，盖上封板膜，室温静置60分钟。

Tips参考2.2.3
5

加检测试剂

每孔加入5μl抗标签供体和5μl抗标签供体。(或可将检测试剂预混在一起，以10μl/孔混合液加入样本中)。盖上封板膜，室温静置，孵育60分钟。

Tips参考2.2.4
6

读板

去掉封板膜，平行放入酶标仪，选择TR-FRET程序进行读值。

举例：Biotin-EGF和EGFR-Fc存在或不存在100nM未标记EGF蛋白时蛋白相互作用实验。在所有实验中，与未标记蛋白的竞争显著降低了HTRF比值，本质上是背景水平，表明信号是蛋白-蛋白相互作用的。

图5：Bio-EGF和EGFR-Fc信号特异性数据

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