2.4 蛋白浓度优化

使用缓冲液制备4X初始浓度的蛋白X和Y。

按照最高浓度进行3倍连续稀释。

选择384孔为例，空板中依次加入4X蛋白X和蛋白Y，盖上封板膜，室温静置60分钟。

Tips参考2.2.3

每孔加入5μl抗标签供体和5μl抗标签供体。(或可将检测试剂预混在一起，以10μl/孔混合液加入样本中)。盖上封板膜，室温静置，孵育60分钟。

去掉封板膜，平行放入酶标仪，选择TR-FRET程序进行读值。

举例：对于p53-HDM2的相互作用，信号与结合成比例地增加，直到我们达到Hook效应，并且信号开始减少。

蛋白质浓度的选择的原则：

1.选择尽可能高的信噪比(S:B)。

2.蛋白浓度应在曲线的线性部分(在Hook效应之前)。

3.避免了比预期的Kd有大量过量的蛋白。

4.减少所使用的蛋白质。

图6：p53-HDM2蛋白相互作用最佳浓度选择

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