3.1 激酶活性检测实验

这一步给出了实验最佳的激酶浓度，即信号达到最大浓度的80%(EC80)。激酶的浓度从0.10ng/孔到10ng/孔，与生物素-底物(1μM)和非限制性ATP浓度(100μM)孵育30min。在EDTA中加入检测试剂后，终止反应。生物素-底物/SA XL665的比例为8/1，即62.2nM SA XL665和Eu标记的磷酸化特异性抗体保持不变。在得到的EC80处选择最佳的酶浓度。如MAPKAP-K2浓度为0.4ng/孔。

 

图9: MAPKAP-K2浓度

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使用上述实验中确定的激酶浓度，每孔0.4ng MAPKAP-K2，1µM底物和非限制性ATP浓度(100μM)。通过加入检测试剂在1、2、5、10、15、30和60 min不同时间停止反应。MAPKAP-K2浓度为0.4ng/孔达到最大信号，并选择5 min的线性时间，该孵育时间在接下来优化时间中保持不变。

 

图10: MAPKAP-K2反应时间

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使用上述酶浓度：0.4ng/孔，孵育时间：5 min，底物浓度从1nM到2μM。在检测步骤中，调整SA-XL665的浓度，使生物素-底物/链霉亲和素-XL665的比值保持在8/1。绘制信号与底物浓度的关系，使用米氏-Menten方程计算得到80nM的K_M(app)。

 

图11: MAPKAP-K2底物浓度

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酶浓度0.4ng/孔，孵育时间5 min，ATP为1.7 nM至300μM，得到2.3µM的ATP K_M(app)。

 

图12: ATP浓度

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生物素-底物/SA-XL665比值也是影响信号的因素。该实验使用上述已确定的酶、ATP和底物浓度进行。生物素-底物/链霉亲和素-XL665的摩尔比为2/1、4/1、8/1。

选择原则：

1.信噪比佳；

2.减少所使用的试剂。

 

图13: MAPKAP-K2生物素-底物/SA-XL665为4/1

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通过上述步骤确定的最终检测体系为，酶浓度：0.4ng/孔，孵育时间：5 min，ATP 2.3µM，底物浓度80nM和生物素-底物/链霉亲和素-XL665的摩尔比为4/1。在此条件基础上，进行下一步抑制剂筛选实验。

微孔板中依次加入4μl Staurosporine，2μl生物素-底物 ，2μl激酶 ，2μl ATP，37℃孵育5分钟后，加入检测试剂各5μl，加盖封板膜，室温静置60分钟。

 

图14: MAPKAP-K2 Staurosporine IC50：92nM

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综上所述，本实验最终优化体系为：酶浓度：0.4ng/孔，孵育时间：5 min，ATP 2.3µM，底物浓度80nM和生物素-底物/链霉亲和素-XL665的摩尔比为4/1。Staurosporine抑制剂IC50：92nM