4.1 样本制备

细胞密度是一个关键的参数，必须仔细优化，以适应每个细胞因子试剂盒的检测范围。

如下图所示：检测hIFNγ分泌，PBMCs以每孔500至400万个细胞的不同细胞密度接种到96孔微孔板中，然后用50ng/mL PMA+500ng/mL离子霉素处理(NS)3小时。取细胞上清液并进行检测，结果显示每孔40万个细胞时，所得信号值最佳。

 

图15：hIFNγ细胞密度优化

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以Mouse CCL2检测为例，3T3-L1细胞以每孔30000个细胞在12孔板培养。细胞生长至融合，并在脂肪细胞中分化(每孔70万个细胞)。后用10 ng/mL的IL1β和TNFα刺激分化细胞24小时。

上清液按图16中所示进行连续稀释，刺激组未稀释的上清出现了hook效应，1/100的稀释比例为量化非刺激和刺激组的最佳条件。

 

图16：mCCL2细胞上清优化

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图17(左)显示了在过夜孵育期间，PBMCs(20万个细胞/孔)处理后，随着LPS浓度的增加，TNFα释放的剂量反应曲线。测定LPS的EC80，用JTE-607化合物建立抑制曲线，孵育过夜，如图17(右)所示。

 

图17：TNFα的释放随LPS浓度升高而升高

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一些细胞因子，如IL2会在短时间的处理(2小时)后释放，而有些细胞因子，如TGFβ，可能需要更长的时间(高达48小时)。因此，孵育时间的优化也是必要的环节。

在本例中，PBMC以每孔100000个细胞于96孔微孔板中，后用0.2µg/mL的LPS刺激3小时或过夜(ON)。如图18所示，过夜刺激使IL1β和IL6的释放强度强于3h。

 

图18：过夜刺激使IL1β和IL6的释放强度强于3h

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