3.2 实验优化

TR-FRET信号与化合物处理产生的磷酸化和总蛋白的数量成正比，直到达到平台期。如果磷酸化蛋白的含量明显高于微孔板中存在的检测试剂，则信号减弱，即“Hook效应”。为了避免Hook效应，需要对每个磷酸化蛋白或总蛋白检测试剂盒、基于每个细胞的模型甚至每个实验条件仔细优化细胞密度。不同细胞的最大细胞数量有所差异，不当的细胞密度优化可能影响化合物IC50的测定。
如图所示，用EGF处理HEK293细胞后，在每孔达到80,000个细胞时，对于磷酸化ERK的研究结果是最佳的。
 

图9. 一板法检测phospho-ERK1/2
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H358细胞(5K, 10K, 20K，40K细胞/孔)培养过夜，然后血清饥饿18小时。然后将细胞与抑制剂RMC-4550的连续稀释液在37℃下孵育60分钟。数据显示RMC-4550处理H358细胞可抑制ERK1/2在T202/Y204位点的基础磷酸化。

图10. RMC-4550抑制ERK1/2的磷酸化
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Tips：细胞数量过高或过低都会对细胞内信号通路的激活产生负面影响。对于大多数细胞系来说，贴壁细胞的细胞播种密度为40,000- 80,000个细胞/孔，悬浮细胞的细胞播种密度为100,000-200,000个细胞/孔。

在研究特定信号通路时，饥饿处理有助于降低目标蛋白质的磷酸化水平。通常情况下，通过移除细胞培养基中的血清，可以实现细胞的饥饿状态。但对于某些细胞模型而言，血清的存在对于确保细胞适当的贴壁或生长至关重要。在这些情况下，可以将血清浓度降低至0.5%或2%。此外，还需要对血清饥饿的处理时间进行优化，以确保实验条件符合研究需求。

图11. 血清饥饿优化
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化合物通常在含有或不含有10%胎牛血清（FCS）的细胞培养基中稀释。由于某些化合物容易附着在塑料瓶上，因此建议在细胞培养基中补充0.1%的牛血清白蛋白（BSA），尤其是在需要饥饿步骤的情况下。
对于悬浮细胞，无论是采用两步法还是一步法，都建议使用不含酚红的细胞培养基。可以使用HBSS或类似的缓冲液来稀释细胞和化合物。另外，孵育时间超过30分钟可能会影响细胞活性，进而影响药效。

蛋白质磷酸化状态和其表达水平的适宜时间窗口可能各有不同，而不同细胞系对最佳刺激时间的反应也表现出显著差异，这个时间跨度可能从几分钟到一个多小时不等。
此外，剂量反应实验是通过对细胞施加不同浓度的化合物（激活剂或抑制剂）来实现的，同时需要设置未处理的对照组，以提供磷酸化或蛋白质表达的本底水平，与实验数据进行比较。

图12. 两板法检测方案
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