4.1 实验优化

TR-FRET信号与定量分析物成正比，直到达到平台期。如果细胞因子的的含量明显高于微孔板中存在的检测试剂，则信号下降，即“Hook效应”。为了避免Hook效应，需要对每个细胞因子试剂盒，基于细胞模型，甚至每个参数的实验条件进行优化，其中细胞密度是一个关键参数。
对于大多数细胞系来说，接种密度建议每孔按照500至400,000个细胞进行优化，以获得最佳S/B确认最佳的细胞密度。 

图13. Hook效应示意图
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为了确保在检测范围内进行检测，需要对细胞上清液进行稀释，如进行倍比稀释1/3, 1/10, 1/20, 1/100, 1/200，使得刺激和非刺激细胞定量落在标曲内，并确认最佳稀释比。如下图，倍比稀释1/3的细胞上清，明显呈现hook效应，是不可取的稀释比。

图14. 细胞上清液稀释优化
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对于识别新的激动剂或抑制剂，药理学参数如 IC50，IC10 或 IC80比较重要。通常建议化合物做3~5个梯度稀释，以获得最佳的EC50作为参考标准。 

图15. hTNFα 的释放随LPS浓度升高而升高
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确定使用激动剂或抑制剂的最佳处理对于达到最佳细胞因子释放至关重要。一些细胞因子，如IL2，将在较短的治疗期（2h）后释放，而其他细胞因子可能需要更长的时间（长达48小时）。一般刺激之后进行标曲回算定量，浓度稳定以判定最佳刺激时间。

图16. 细胞因子释放强度随着化合物刺激时间增强
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