5.1 细胞处理

1. 细胞从T175 cm2收集前烧瓶应接近80%的汇合度。除去培养基，用PBS轻轻冲洗烧瓶。
2. 加入细胞解离液(5mL / T175 cm2烧瓶)，在37°C和5% CO2条件下孵育板5-10分钟或直到细胞脱落。
3. 加入5mL PBS至最终体积10mL，上下移液，直到细胞均匀分散在溶液中。将细胞悬液以340 g离心3分钟。
4. 计算重新悬浮细胞颗粒所需的刺激缓冲液体积，以达到最佳细胞密度。
Tips：在重新悬浮细胞时，一定要使用刺激缓冲液。

1. 细胞从T175 cm2收集前烧瓶应接近80%的汇合度。除去培养基，用PBS轻轻冲洗烧瓶。
2. 加入细胞解离液(5ml / T175 cm2烧瓶)，在37°C和5% CO2条件下孵育板5-10分钟或直到细胞脱落。
3. 加入5ml PBS至最终体积10ml，上下移液，直到细胞均匀分散在溶液中。将细胞悬液以340 g离心3分钟。
4. 计算重新悬浮细胞颗粒所需的完整培养基的体积，以达到最佳细胞密度。
可以选择细胞培养处理过的孔板或聚d-赖氨酸包被板。准备将细胞分配到实验板中37°C, 5% CO2孵育过夜。
5. 翻转平板，除去细胞上清，开展实验。

1. 在37°C的水浴中快速解冻冷冻细胞，直到完全解冻。
2. 将细胞转移到小瓶中，加入10毫升PBS。340 rcf (g)离心3分钟。
3. 丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在刺激缓冲液中。
4. 测定细胞浓度和活力。
5. 在刺激缓冲液中稀释细胞以达到实验所需的细胞浓度。

表3.不同cAMP测定的移液方案

△点击放大图片

Tips 1：未经处理的细胞接受相同体积的刺激缓冲液，并与处理过的细胞孵育相同的时间和温度。
Tips 2：可以孵育18小时后进行读数，不会对分析产生影响。
Tips 3：不要将FR-anti-cAMP和Eu-SA/biotin-cAMP预混。