5.2 标准曲线绘制

a.使用前准备好工作标准液，并在一小时内使用。请勿储存工作液。
b.每孔需要5µL的标准品工作液。在稀释时，每个浓度之间需要更换枪头。在每次转移标准品之前，需要将稀释孔混合均匀。
下面的部分为双复孔标准曲线的准备(推荐)。用试剂盒中的50µM cAMP标准液在刺激缓冲液中配制4X cAMP标准液系列稀释液，如下表所示。

表4. cAMP标准曲线的配制

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通过绘制Ratio作为不同标准的[cAMP]的函数来分析曲线，以对数表示。Graphpad Prism可以用来分析曲线。建议选择log(inhibitor) vs. response -- Variable slope模型。从拟合中可以得到几个参数:

图19. THUNDER™ cAMP 标准曲线
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该标曲是由刺激缓冲液稀释的THUNDER™ cAMP 标准曲线，左图为氙灯激发，右图为激光激发。数据为每种标准品一式两份（3 孔）的平均值±标准偏差。检测工作范围定义为 IC10 至 IC90。数据是使用配备 TR-FRET 模块的酶标仪读取低容量 384 孔白板，经过 1 小时和过夜培养后得出的。请注意，根据所用仪器和试剂盒批次的不同，计数水平和 S/B 比值可能会略有不同，但不会影响检测的稳定性。
1.最大分析窗口和IC50
标准曲线分析窗口是通过在没有cAMP时得到的Ratio除以测试最高浓度cAMP标准时得到的Ratio得到的。它代表了从系统中可能获得的最高可实现的分析窗口，并且将始终高于添加细胞的分析窗口。

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IC50可以反映cAMP浓度变化方面的效率和反应。在cAMP的浓度达到IC50时，实验中存在的cAMP使得Biotin-cAMP /FR-anti-cAMP antibody 产生的初始FRET有一半被竞争掉。
2.动态范围
IC10 - IC90 决定了检测的动态范围，细胞检测时的信号必须在标准曲线的检测线性范围内，否则在对细胞进行化合物化验时将会导致结果不准确。
使用Graph Prism确定标准曲线IC10和IC90值，记录相应的Ratio和[cAMP]。测定动态范围表明该测定方法可以准确定量cAMP的浓度范围。cAMP浓度高于IC90或低于IC10的样品不能准确的进行预估。同样，Ratio值低于IC90而高于IC10的样本也不能准确的进行预估。