标准曲线可以评估检测灵敏度(IC50)、最大检测窗口和检测动态范围(IC10-IC90)。每次实验时应包括cAMP标准曲线，以验证该分析是否产生预期的IC50值和S/B比，并将TR-FRET信号转换为cAMP水平。需要优化检测条件，包括细胞密度、福斯克林浓度、激动剂浓度，以使测量的TR-FRET信号落在标准曲线的工作范围内。由于信号与cAMP浓度呈s型关系，因此标准曲线顶部区域的信号对cAMP浓度的变化非常敏感，而底部区域的信号对cAMP浓度的变化不敏感。
实验步骤
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标准品制备
1.使用前准备好工作标准液，并在1小时内使用。请勿储存工作液。
2.每孔需要5µL的标准品工作液。在稀释时，每个浓度之间需要更换枪头。在每次转移标准品之前，需要将稀释孔混合均匀。
下面的部分为双复孔标准曲线的准备(推荐)。用试剂盒中的50µM cAMP标准液在刺激缓冲液中配制4X cAMP标准液系列稀释液，如下表所示。表4. cAMP标准曲线的配制
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标准曲线分析
通过绘制 Ratio 作为纵坐标，不同标 cAMP 浓度作为横坐标（以对数表示）。Graphpad Prism 可以用来分析曲线。建议选择log(inhibitor) vs. response -- Variable slope模型。从拟合中可以得到几个参数:
图20. THUNDER™ cAMP 标准曲线
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该标曲是由刺激缓冲液稀释的THUNDER™ cAMP 标准曲线，左图为氙灯激发，右图为激光激发。数据为每种标准品一式两份（三复孔）的平均值±标准偏差。检测工作范围定义为 IC10-IC90。数据是使用配备 TR-FRET 模块的酶标仪读取白色384孔浅孔板，1 小时和过夜检测。注意，根据所用仪器和试剂盒批次的不同，计数水平和 S/B 可能会略有不同，但不会影响检测的稳定性。
1.最大分析窗口和IC50
标准曲线分析窗口是通过在没有cAMP时得到的Ratio除以测试最高浓度cAMP标准时得到的Ratio得到的。它代表了从系统中可能获得的最高可实现的分析窗口，并且将始终高于添加细胞的分析窗口。
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IC50可以反映cAMP浓度变化方面的效率和反应。在cAMP的浓度达到IC50时，实验中存在的cAMP使得Biotin-cAMP /FR-anti-cAMP antibody 产生的初始FRET有一半被竞争掉。
2.动态范围
IC10 - IC90 决定了检测的动态范围，细胞检测时的信号必须在标准曲线的检测线性范围内，否则在对细胞进行化合物化验时将会导致结果不准确。
使用Graph Prism确定标准曲线IC10和IC90值，记录相应的Ratio和[cAMP]。测定动态范围表明该测定方法可以准确定量cAMP的浓度范围。cAMP浓度高于IC90或低于IC10的样品不能准确的进行预估。同样，Ratio值低于IC90而高于IC10的样本也不能准确的进行预估。