3.1 细胞处理（两板法）

1.96孔细胞培养板中加入50 μL细胞（按预先优化的密度）。
2.37°C, 5% CO₂孵育培养。
3.若研究药物为激动剂：
a.加入50 μL激动剂(2X)，激动剂可使用无血清培养基稀释。
b.在室温(RT)或37°C下孵育一定时间（实验优化时间）。需要确定最佳孵育温度。
4.若研究药物为抑制剂：
a.加入25 μL抑制剂(4X)，抑制剂可使用无血清培养基稀释。
b.在RT或37°C下孵育一定时间（实验优化时间）。需要确定最佳孵育温度。
c.加入25 μL激动剂(4X)，激动剂可使用无血清培养基稀释。
d.在RT或37°C下孵育一定时间（实验优化时间）。需要确定最佳孵育温度。

1.96孔细胞培养板中加入 20µl 细胞（按预先优化的密度）。
2.直接进行细胞处理或在37°C 5% CO2中孵育2-4小时（刺激时间可以调整）。
3.若研究药物为激动剂：
a.加入20 μL激动剂(2X)，激动剂可使用无血清培养基稀释。
b.在室温(RT)或37°C下孵育一定时间（实验优化时间）。需要确定最佳孵育温度。
4.若研究药物为抑制剂：
a.加入10 μL抑制剂(4X)，抑制剂可使用无血清培养基稀释。
b.在RT或37°C下孵育一定时间（实验优化时间）。需要确定最佳孵育温度。
c.加入10 μL激动剂(4X)，激动剂可使用无血清培养基稀释。
d.在RT或37°C下孵育一定时间（实验优化时间）。需要确定最佳孵育温度。

图8. 两板法细胞处理

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1.去除培养基：用移液器小心地除去细胞培养基。

2.细胞裂解：加入50 μL裂解缓冲液（1X）。保证细胞充分裂解的情况下裂解液可以在25-50µl 进行调整。

3.孵育：在室温（RT）下振荡孵育30分钟（轨道式平板摇床设置为400 rpm）。裂解孵育时间15-60 分钟之间进行调整。

Tips：裂解物可直接用于目标蛋白检测或在-80°C 冷冻。细胞裂解步骤通常在室温下进行30min。增加孵育时间可能增加裂解液粘度。如果需要更高的实验窗口（S/B），可减少裂解液的体积，此方法适用于两板法贴壁细胞检测。