视频素材来源于Polyplus https://www.youtube.com/watch?v=f1R6gdB9XXY
版权归原作者所有
阳离子聚合物法以阳离子聚合物PEI(Polyethylenimine)为载体，进行细胞转染的技术。PEI带正电，可以包裹带负电的核酸，形成核酸-聚合物的复合物，在静电作用下贴附在细胞膜上，通过内吞作用进入细胞。
以下以jetPRIME进行DNA转染为例进行介绍：
实验步骤
- 1
- 2
- 3
- 4
-
细胞接种
为了达到最佳的DNA转染条件，我们建议在细胞汇合度为60%-80%时进行转染。通常，用6孔板进行实验时，转染前24H在每个2mL的孔里接种大约200000个细胞。其他的规格参见下表：
Culture vessel Number of cells to seed Surface area per well (cm2) Volume of medium per well to seed the cells (mL) 96-well 7500-25 000 0.3 0.125 24-weII 40 000-100 000 1.9 0.5 12-well 80 000-150 000 3.8 1 6-well / 35mm 150 000-400 000 9.4 2 60mm/flask 25cm2 200 000-850 000 25-28 5 100mm / flask 75cm2 1x106-4x106 75-78.5 10 150mm / flask 175cm2 5xl06 153-175 20 -
混合DNA和转染试剂
以下的实验步骤以6孔板的一个孔为例，其他的规格参见下表。
将2µg DNA稀释到200µL jetPRIME缓冲液中。通过涡旋混合；涡旋震荡jetPRIME试剂5秒，使用前短暂离心；在DNA中添加4µL jetPRIME试剂，涡旋震荡1秒钟，短暂离心；在室温下孵育10分钟；
Culture vessel Volume of buffer (μL) Amount of DNA (μg) Volume of jetPRIME® reagent (μL) Volume of growth medium (mL) 96-well* 10 0.1 0.2-03 0.1 24-weII 50 0.5 1-1.5 0.5 12-well 75 0.8 1.6-2.4 1 6-well / 35 mm 200 2 4-6 2 60 mm/flask 25 cm2 200 4 8-12 5 100 mm / flask 75 cm2 500 10 20-30 10 150 mm / flask 175 cm2 1000 20 40-60 20 -
将混合物加入细胞内培养
将200µL转染混合物逐滴加到含血清培养基的细胞上，确保均匀分布滴加；轻轻地水平摇晃培养板，置于在37°C孵育；如果需要，在转染后4小时至24小时用正常培养基替换转染培养基，并根据需要进行分析；24小时后进行检测。
△点击放大图片
-
如果想进行DNA稳定转染
1）按照上述步骤先进行正常转染；
2）在转染24-48h后开始进行抗生素筛选；先用较低浓度的嘌呤霉素处理1-3天，使用胰酶消化逐步稀释传代的方式，来获得单克隆细胞系。将细胞以较低的密度铺到细胞培养板中，正常培养基来培养，待细胞生长到一定密度时，加入2μg/mL浓度的嘌呤霉素继续培养。
3）检测质粒DNA的融合和目标蛋白的稳定表达；