4.1 细胞成像

活细胞成像是通过显微观察研究活细胞的细胞结构和功能的研究方法。活细胞成像统称为捕捉活的、活动状态的细胞图像的技术，这些细胞图像可以是单个静态图像，也可以是延时系列图像。相应地，活细胞成像的应用可以分为两大类：第一，细胞在自然状态下的图像记录；第二，实时观察和记录细胞、组织或整个生物体的动态过程。

活细胞成像可研究活细胞中的实时动态生理过程，单个细胞、细胞内网络(原位)甚至整个生物体(体内)中动态发生分子事件的空间和时间信息，是研究细胞生物学、癌症、发育生物学和神经科学中动态生理过程的必要技术。

众多显微技术被应用于活细胞成像。通常，细胞的生长、细胞聚集体或细胞运动是通过使用复合显微镜以及像相差和微分干涉(DIC)这样的方法来观察的；对更大的标本，如发育中的斑马鱼胚胎进行延时成像，通常使用立体显微镜或宏观显微镜。目前活细胞成像的技术有离子成像、TIRF、FRET和BRET、FRAP、光活化、MPE、FLIM、CARS和SRS、SAFE和RNA成像技术。

细胞胞浆中的离子组成决定了许多重要的功能，如神经元的兴奋性、基因转录和细胞运动，因此细胞内离子在空间和时间上的调节是生命科学研究的主要热点之一。离子(钙、氯、镁)成像是一种常用的方法，它使用荧光染料或特别设计的蛋白质，以改变其在钙结合时的发射行为，使研究人员能够观察细胞离子浓度的动态变化；此外，使用特殊的荧光染料也可以对细胞内的pH值或电压进行成像，是一种用来对离子水平、pH值或电压变化进行成像的特殊技术是比率成像法。因此，离子成像能够精确测定细胞内钙浓度等信息，而不像非比率方法那样监测相对变化。

全内反射荧光(TIRF)是一种特殊的技术，用于观察位于细胞质膜或靠近质膜的事件。通过使用仅穿透细胞60-250nm的荧光激发的消逝场，TIRF显微镜提供了无与伦比的z轴分辨率，它能够对发生在质膜内或靠近质膜的事件进行成像，例如：分子向质膜的运输。此外，TIRF成像还可以避免自身信号被细胞内部更深的分子发出的荧光信号淹没。

要检测动态蛋白质相互作用，可以在活细胞实验中对FRET(荧光共振能量转移)和BRET(生物发光共振能量转移)事件进行成像。FRET是量化分子动力学的有利工具，如蛋白质和蛋白质相互作用、蛋白质和DNA相互作用、蛋白质构象变化等。FRET成像通常使用GFP(绿色荧光蛋白)的衍生物，尤其是CFP和YFP(分别为青色和黄色荧光蛋白)，它们各自使用分子生物学方法连接到感兴趣的目的蛋白质上，然后用相应荧光激发CFP分子。一旦目的蛋白质在空间上接近(<20 nm)，CFP将作为供体并以光的形式发射能量转移给作为受体的YFP，这时可以观察到从CFP发出的蓝色荧光转变为从YFP发出的黄色荧光。使用BRET时，供体是生物发光分子(例如荧光素酶衍生物)，与FRET一样，GFP衍生物作为受体。

光漂白后荧光恢复(FRAP)是一种常用的监测蛋白质或囊泡转运的方法。荧光蛋白(通常是GFP)附着在目的蛋白质上(即要监测此蛋白质的运动)。通常情况下，整个细胞最初发出荧光，因为整个细胞中可能含有丰富的该蛋白质。然后，细胞的某个区域，通常是神经元细胞中的细胞突起，如轴突或树突，暴露在高强度的光下(通常是激光)，该特定区域的荧光被破坏(漂白)。然而，随着目的蛋白质的移动，来自细胞其他区域的蛋白质会以一定的速度重新侵入漂白区域，使漂白区域的荧光恢复。FRAP成像技术让研究人员深入了解胞内运输动力学。

最近开发的一种被称为光活化的方法能够选择性地标记细胞、整个生物体内的特定区域或者感兴趣区域。进行光活化时，使用专门设计的染料或荧光蛋白，如光活化绿色荧光蛋白(paGFP)或Kaede，这些荧光团在正常状态下不发荧光。然而，在用特定波长的光照射后，它们可以像传统荧光团一样被激活，发出荧光。在很多情况下，将这些蛋白质与某些目的蛋白质进行基因融合，可以监测其表达或转运，然后可以应用FRAP或粒子跟踪等方法来进一步研究目的蛋白质。

在细胞培养实验中，现代生物学研究需要真正的体内研究来补充“类似体内”研究，但很难研究像小鼠这样的生物体内发生的过程。多光子激发(MPE)显微镜能够更深入地穿透组织，因为与用于单光子激发的短波长光相比，近红外激发光具有更长的波长、散射更少。MPE技术的非线性特性将光漂白和光毒性限制在焦点区域，这对长期研究非常有益，因为荧光蛋白和生物体都受到这些问题的困扰。据报告，使用合适的标本和显微镜设置，成像深度可以深入组织中数毫米，激发的精确定位使其也适用于光子操纵。该方法在神经生物学中得到了广泛的应用。

荧光寿命成像(FLIM)的优点是数据不依赖于信号强度，因此不受光漂白和浓度变化等常见伪影的影响。使用时间相关的单光子计数，通过单分子检测数据重建FLIM图像，可以记录和分析亚纳秒荧光寿命的最小变化。该方法可用于研究导致荧光寿命改变的任何类型的细胞外和细胞内环境改变，基于FLIM的FRET分析对发射强度不敏感，从而提高了定量数据的精度。

几乎所有的活细胞荧光成像方法都基于荧光蛋白的基因表达，这涉及到大量的技术工作和高昂的费用。此外，外部基因的表达可能会改变微环境，从而导致数据与实际生理学情况的差异。相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜和受激拉曼散射(SRS)显微镜是不依赖于荧光染料的非线性共聚焦方法。这些无标记方法可对样品中特定化学键的振动状态进行成像。生物体中特定化学键的积累，例如轴突周围髓鞘中的脂质，可以在无需染色的情况下以高分辨率和出色的信噪比质量进行成像。

断裂加速荧光体交换(SAFE)是使用快速生物正交点击化学方法从抗体标记的细胞中剥离免疫荧光信号，在几秒钟内完成纳摩尔浓度试剂的生物正交循环，并能对同一样品进行准确无毒的多色成像，且保持其功能性。SAFE方法为不仅探索了活细胞体内抗体递送的非致命方法，解决了在活细胞中进行无毒环境下的荧光蛋白标记和荧光释放问题，还研究了潜在生物正切割反应与任何可偶联染料相容方法，实现对同一个活样本细胞组织进行时间和空间的多次重复标记及多重检测的目标，是目前唯一可在活细胞和组织中进行时空分析的技术。此外，SAFE方法可以进一步扩展，以增加每个谱中的周期和靶标的数量，组装更广泛的标记板，用于研究复杂的活组织，特别是在复杂的免疫环境中，如淋巴结，扁桃体，脾脏或肿瘤组织等。

RNA成像技术在固定细胞和活细胞中都在快速发展。在固定细胞中，目前的方法已经取得了高通量的成像，并能够定位和定量整个转录组的表达水平；在活细胞中，成像是低通量的，这个限制是由于每种颜色只能对应一种基因，但活细胞RNA成像的优势是通过成像分辨率的提高能够加深我们对RNA代谢动态的理解。