组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状),应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动,使团块膨松,由块状变成絮状,此时再采用机械法,用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡,使细胞团块得以较充分的分散,制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液,接种培养后,细胞容易贴壁生长。具体操作步骤如下:
实验步骤
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剪切组织
剪切,把组织块剪碎,呈1~5mm3大小的组织块;
漂洗
加液漂洗,将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜、自然沉降法);
消化
消化,加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次),若组织块膨松呈絮状可终止;
若变化不大可更换一次消化液,继续消化直至膨松絮状为止,但是要注意胰蛋白酶消化时间不宜过长;
离心去除消化液
弃去消化液,采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液;
中止消化
漂洗,将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入,中止消化反应,采用漂洗法洗2-3次后,加入完全培养基;
过滤
机械分散,采用吸管吹打或振荡法,使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养,若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟,吸上层细胞悬液进行分瓶培养。