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3.5.1 慢病毒转染贴壁细胞

| 3.5.2 慢病毒转染悬浮细胞

视频素材来源于YouTube  https://www.youtube.com/watch?v=NKuJ8ARm7AI
版权归原作者所有

 

某些病毒具有携带外源基因并且有效转运这些基因的能力,因此被用来作为基因运输载体。

病毒转染系统的分类:目前常用的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等。

 

不同转染系统的比较

△点击放大图片

实验步骤

  • 1
  • 2
  • 3
  • 1

    细胞培养

    慢病毒转染前18-24小时,将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中,使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右;

  • 2

    病毒感染

    第二天感染前,根据MOI值将病毒稀释成所需浓度。吸去细胞原有培养基,将按照MOI稀释好的病毒液+培养基+Polybrene(终浓度6μg/mL)混合物加入细胞中。混合液的配制方法如下:①添加完全培养基(60mm培养皿2mL,100mm培养皿3mL),37°C预热;②加入病毒轻轻混匀;③加入Polybrene至终浓度为2μg-12μg/mL。轻轻混匀。以上每个成分需要按顺序加入。当MOI高于20时 ,建议添加Polybrene(终浓度2~12μg/mL,浓度因不同的细胞而异,具体的请参考相关文献)来提高病毒的感染效率。轻轻摇匀,37℃培养过夜。

    (对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2mL新鲜培养基以稀释polybrene;

  • 3

    继续培养并检测

    继续培养24小时,用新鲜培养基替换含有病毒的培养基;继续培养,如果慢病毒含有荧光蛋白,一般转染48小时后可见明显荧光表达,72小时后更加明显;如需FACS检测转染效率,可在转染后72-96小时进行;如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选,可以在转染3-4天后开始加药。

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