对活细胞染色可以更好的了解细胞内生命活动的状态及其变化,其难点在于活细胞细胞膜的选择透过性,会阻止外界物质的进出,因此选择合适的荧光染料至关重要。下面为大家介绍几种常用的活细胞探针。
实验步骤
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肌动蛋白,肌管蛋白
对于活细胞中的肌动蛋白或者肌管蛋白染色,最好的方式是使用低细胞毒性,高特异性,可通过活细胞的细胞呈像探针(SIR-actin,SIR-Tubulin)。
细胞核
对细胞核进行染色主要使用能和DNA相结合的探针,活细胞的细胞核荧光探针常用为SIR-DNA或SPY-DNA。
线粒体
为了在活细胞中对线粒体进行标记,也需要借助专门的荧光探针试剂。细胞在一定浓度的特定探针中培养后,探针会通过被动扩散穿过细胞膜并在活性线粒体中积累。常用的探针有MitoTracker® Red CMXRos和MitoTracker® Deep Red FM等。
溶酶体
常见的针对活细胞中溶酶体的荧光探针包括LysoTracker™系列,由于其对酸性细胞器有高度选择性(溶酶体内部pH约3.5~5),因此可以对溶酶体进行特异性染色。相比LysoTracker™,LysoBrite™的探针在长时间追踪活细胞中的溶酶体上,具有更明显的优势。LysoBrite™染料可以在活细胞中停留超过一周,细胞毒性极小,而LysoTracker染料只能使用几个小时。且LysoBrite™染料比LysoTracker染料更具有光稳定性,
内质网和高尔基体
内质网和高尔基体主要负责细胞内脂质和蛋白质的分类,因此,针对这两个细胞器的大部分染色探针都是脂质或是可以影响蛋白质运动的化学物质。在活细胞中,内质网和高尔基体的扁平膜囊可以用各种亲脂探针进行染色,然后根据其形态进行区分。ER-Tracker™ 系列的染色探针针对的是活细胞,对ER具有高度选择性。还有一类荧光鞘脂衍生物(sphingosine derivative),如NBD C6-ceramide、BDP FL-ceramide等,也是内质网/高尔基体在活细胞中的重要染色探针之一。
细胞膜和细胞器膜
细胞脂膜是动态的、流体结构(约4纳米厚),这是生物学上的必要条件,因为若要细胞参与基本的细胞和亚细胞生理功能(如迁移、细胞扩散、吞噬、细胞分裂、内吞、机械转导和代谢等),则需要这些细胞膜/基质膜能够改变形状和张力。对细胞膜张力的研究在细胞生理学中很重要。荧光膜张力探针Flipper-TR®(Spirochrome, Ltd.)可以对活细胞中的膜结构进行特异性染色,以对膜的张力进行研究。除此之外Flipper-TR®探针还提供针对其他细胞器膜/基质膜(Plasma membrane)的染色,如溶酶体膜、线粒体膜、内质网膜。