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4.5.2 BrdU法检测细胞增殖

| 4.5.3 EdU法检测细胞增殖

视频素材来源于YouTube  https://www.youtube.com/watch?v=D5BbVd3szH4
版权归原作者所有

 

BrdU预处理的细胞中,BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中,而且这种置换可以稳定存在,并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后,可用免疫学方法检测DNABrdU的含量(如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记,最后用比色法或荧光的方法进行定量测定),从而判断细胞的增殖能力。

实验步骤

  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 5
  • 6
  • 1

    种植细胞

    细胞以1.5×105/mL细胞数接种于直径35 mm培养皿中(内放置一盖玻片),培养1d,用含0.4%FBS培养液同步化3d,使绝大多数细胞处于G0期;

  • 2

    加入BrdU溶液

    加入BrdU溶液(储液:1.0mg/mL,终浓度为0.03μg/mL)37℃,孵育40min;弃培养液,玻片用PBS洗涤3次;

  • 3

    固定及灭活

    甲醇/醋酸固定10min;经固定的玻片空气干燥,0.3%H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶;

  • 4

    封闭

    5%正常兔血清封闭;甲酰胺100℃5min变性核酸;

  • 5

    加抗体

    冰浴冷却后PBS洗涤,加抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1:50),阴性对照加PBS或血清;

  • 6

    检测

    ABC法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数,计算标记指数(LI)

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