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用BrdU预处理的细胞中,BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中,而且这种置换可以稳定存在,并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后,可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记,最后用比色法或荧光的方法进行定量测定),从而判断细胞的增殖能力。
实验步骤
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种植细胞
细胞以1.5×105/mL细胞数接种于直径35 mm培养皿中(内放置一盖玻片),培养1d,用含0.4%FBS培养液同步化3d,使绝大多数细胞处于G0期;
加入BrdU溶液
加入BrdU溶液(储液:1.0mg/mL,终浓度为0.03μg/mL),37℃,孵育40min;弃培养液,玻片用PBS洗涤3次;
固定及灭活
甲醇/醋酸固定10min;经固定的玻片空气干燥,0.3%H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶;
封闭
5%正常兔血清封闭;甲酰胺100℃,5min变性核酸;
加抗体
冰浴冷却后PBS洗涤,加抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1:50),阴性对照加PBS或血清;
检测
按ABC法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数,计算标记指数(LI)。