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JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位,线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。正常生理状态下,线粒体负电性高,JC-1进入线粒体以多聚体存在,红色荧光强,细胞凋亡时,线粒体去极化产生,负电性降低,JC-1则以单体存在细胞质,绿色荧光增强。具体操作步骤如下:
实验步骤
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配制JC-1工作液
JC-1染色工作液的配制,按照试剂盒说明配制相应用量的JC-1染色工作液;
设置阳性对照
设置阳性对照,阳性对照为CCCP, 按照10μM的终浓度37℃处理细胞20分钟;
收集细胞
若用流式仪检测,则收集细胞,悬浮细胞直接收集,贴壁细胞消化后收集,细胞1000rpm离心后3分钟,去上清液,用0.5mL细胞培养液重悬;
加入JC-1染液
加入0.5mL JC-1染色工作液,混匀后置CO2培养箱继续孵育20分钟;
以600g,4℃离心3分钟,用移液器小心移去上清。用JC-1染色缓冲液洗2次,以600g,4℃离心,每次3分钟;弃上清,每管加500μL JC-1染色缓冲液重悬细胞;
检测
以流式细胞仪检测细胞,每个样品检测,10000个细胞,获取检测数据并分析;
如果用荧光显微镜检测
若用荧光显微镜拍照检测,则不用收集细胞,需检测的细胞去除培养基,PBS洗涤1次;加入1mL JC-1染色液,细胞培养箱中孵育20分钟;去除上清,用JC-1染色缓冲液洗涤2次;加入1mL细胞培养基,荧光显微镜下观察拍照。