实验步骤
- 1
- 2
- 3
- 4
- 5
- 6
- 7
- 8
- 9
- 10
- 11
- 12
- 13
- 14
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研磨
取10-250mg植物组织，在液氮中将组织研磨成粉末;
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收集样品
将磨好的组织粉末转移到2ml的EP管中，此过程快速冰上操作，以最大程度地减少蛋白质降解。
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甲醇萃取，去单宁
加入1.5ml准备好的甲醇溶液，-20°C孵育5min，孵育的过程涡旋混匀一到两次，以免组织沉淀;
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离心
将悬浮液在4°C下16,000g离心5min;
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收集沉淀
用移液枪吸掉上清，注意不要打乱沉淀;
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重复3-5两次
重复步骤(3)(4)(5)两次;
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丙酮萃取，去核酸
加1.5ml的-20°C预冷的丙酮，迅速涡旋混匀样品(15‒30S)，然后置于-20°C孵育5min;
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离心
将悬浮液在4°C下16,000g离心5min以沉淀蛋白质和植物组织碎片;
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收集沉淀
用移液枪去除上清，注意不要打乱沉淀;
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风干
室温下将颗粒风干(5-10min)，以除去残留的丙酮;
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称重
干燥样品后，称重以确定植物组织的重量;
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提取
按每mg植物组织加入4ul的试剂盒中的溶液4，通过涡旋充分混匀组织沉淀，室温孵育15min;
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取上清
16,000g 4°C离心30min以沉淀植物组织碎片，提取上清液，不要吸取到沉淀，样品制备完成，制备好样品可以分装保存于-80°C中。
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注意事项:
(1) 组织应是新鲜或者冰冻保存的，如果组织有变黄或者腐烂，则需另取一批新鲜组织进行实验。高纤维组织可能需要长时间的研磨;
(2) 有些植物组织含有较高酚和单宁，可能需要多次使用甲醇溶液进行去除，最后一次吸掉上清后，将试管倒置在干净的纸巾上，以最大程度的去除甲醇;
(3) 步骤(12)温度需保持在15-30°C之间，因为温度太高容易导致蛋白的降解，温度太低溶液中的尿素和硫脲会沉淀出来。