该流程是按照Thermo的89842 Mem-PERTM Plus膜蛋白提取试剂盒来进行，此试剂盒包含的组分如下表:
| 组分 | 89842 |
| 细胞清洗液 | 225ml |
| 增溶缓冲液 | 25ml |
| 透化缓冲液 | 50ml |
储存要求:收到产品后立即将细胞清洗液和增溶缓冲液储存于 4°C 。 将透化缓冲液分装并储存在-20°C， 避免反复冻融。产品冰上运输。
其他试剂盒中不含的试剂需要自行准备。如果使用其他品牌的试剂盒，可以参考其说明书进行操作。
实验步骤
- 1
- 2
- 3
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贴壁培养/悬浮的哺乳动物细胞膜蛋白提取操作步骤
(1) 用细胞刮将细胞从培养皿上刮下，将细胞重悬在生长培养基中，将得到的细胞悬液以300g离心5min收集细胞沉淀。如果为悬浮细胞，可以直接300g离心5min收集细胞沉淀;
(2) 用3ml细胞清洗液清洗细胞沉淀，300g离心5min;
(3) 丢弃上清液，将细胞重悬在1.5ml的细胞清洗液中并转移到2ml的离心管中，300g离心5min，并丢弃上清液;
(4) 加入0.75ml透化缓冲液到细胞沉淀中，短暂涡旋以获得充分混匀的细胞悬液，在振荡器上4°C孵育10min;
(5) 将透化后的细胞4°C下以16000g离心15min，小心去掉含有胞质蛋白的上清液并转移到一个新的管子中;
(6) 加0.5ml的增溶缓冲液到沉淀中并用移液器轻轻吹打进行重悬，在振荡器上4°C孵育30min;
(7) 4°C下16000g离心15min。将含有可溶性膜蛋白和膜相关蛋白的上清液转移到一个新的管子中，样品制备完成，制备好的样品可以分装保存于-80°C中。 -
动物软组织膜蛋白提取操作步骤
(1) 将20-40mg的新鲜软组织放置于5ml的微型离心管中，加4ml的细胞清洗液到组织中，短暂涡旋并弃掉清洗液;
(2) 将组织转移至2ml的组织研磨器中并用剪刀将组织剪切成小块，加1ml的透化缓冲液到组织中并研磨直到形成均一的悬液;
(3) 再加1ml的透化缓冲液并转移匀浆到一个新的反应管中，在振荡器上4°C孵育10min;
可选步骤:在加透化缓冲液之前，可以采用合适的滤器将较大的组织颗粒滤掉。
(4) 4°C下16000g离心15min，小心地去掉含有胞浆蛋白的上清液并转移到一个新的管子中;
(5) 加0.5ml的增溶缓冲液到沉淀中并用移液器轻轻吹打进行重悬，在振荡器上4°C孵育30min;
(6) 4°C下16000g离心15min。将含有可溶性膜蛋白和膜相关蛋白的上清液转移到一个新的管子中，样品制备完成，制备好的样品可以分装保存于-80°C中。 -
注意
(1) 为了得到最佳的效果，要在透化缓冲液和增溶液缓冲液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂;
(2) 从不同类型样品中提取膜蛋白的流程会有差异，请按所用的样品类型选择恰当的方案;
(3) 一次实验需要5×106个左右细胞，如果细胞量太多，可以分成几管处理。