膜通常是指孔径0.1-0.45μm的多孔材料，其结合能力主要取决于孔径大小。
具有许多小孔的膜比具有较大孔的膜具有更大的结合表面，因此通常具有更高的结合能力。
生物分子与膜相互作用的确切机制尚不清楚，目前普遍认为是非共价力和疏水力的组合。
虽然蛋白质构象和缓冲液组成同样影响结合能力，但是Western印迹的灵敏度主要取决于固定在膜上并可以结合一抗的蛋白总量。
然而，过量的蛋白结合不一定提高WB的信号强度，可能具有相反的效果。
这是因为高浓度的蛋白通过弱相互作用力自我结合，此结合力强于蛋白与膜的结合力。
这意味着蛋白质/抗体复合物在洗涤时很容易从膜上洗掉。
实验步骤
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膜的选择指南
分子量 膜的孔径 ≤10kd 0.1um ≤20kd 0.2um ≥20kd 0.45 um -
硝酸纤维素(NC)和PVDF膜是用于Western blotting最常见的膜，PVDF膜和NC膜特性及应用的比较
特性 硝酸纤维素膜NC PVDF 蛋白结合能力 80-100μg/cm2 100-300μg/cm2 总蛋白染色 胶体金 胶体金 丽春红 丽春红 氨基黑 氨基黑 印度墨汁 印度墨汁 Sypro印迹染料 考马斯亮蓝 检测 显色 显色 化学发光 化学发光 荧光 荧光 放射性 化学荧光 放射性 间接印迹方法 否 是 快速免疫检测 否 是 Western再次杂交 否 是 Edman测序 否 是 氨基酸分析 是 是 SDS存在下的结合 差 好 膜上消化或质谱分析 否 是 -
转膜缓冲液的配方
10X转膜缓冲液:1L，Tris:30.3g，Glycine:144g，加入约800ml的去离子水，搅拌溶解;定容至1L，室温保存。