4.1 封闭需准备的试剂

蛋白	缓冲液	推荐浓度	适用膜
BSA	TBST、TBS	0.2%—5%(W/V)	NC、PVDF
脱脂奶粉	TBST、TBS	3%—5%(W/V)	NC、PVDF
Amersham ECL Prime封闭液(含有脱脂牛奶)	TBST、TBS	2%—5%(W/V)	NC、PVDF
酪蛋白	TBST、TBS	5%(W/V)	NC、PVDF
鱼胶	TBST、TBS	2%—10%(W/V)	NC、PVDF

蛋白	封闭条件
脱脂奶粉	最常见的封闭液，通常将1-5%脱脂奶粉加入到TBST或者TBS溶液中使用。脱脂奶粉很便宜，且背景干净。不过需要注意的是，5%脱脂奶粉溶液容易变质，不宜重复使用。
鱼胶	鱼胶比哺乳动物来源的明胶具有更少的氢结合氨基，因此往往具有更低的背景。鱼胶通常使用2%的浓度， 40°C以下易于溶解。但是，它含有一些竞争性反应物，如生物素。
BSA	BSA相对便宜，并且对大部分实验都适用。TBST或TBS的浓度降至0.3%-3%，在背景较深的情况下可以选 择性添加0.1%的吐温-20。磷酸化实验时，建议使用2%浓度的BSA。
血清	常使用10%的马或胎牛血清，溶液含有0.02%叠氮化钠。这种封闭液价格昂贵，并可能出现交叉反应。

注意:

不同厂家、不同批次脱脂奶粉的含量及质量有所不同。
由于每对抗原-抗体结合都具有特异性，没有单个封闭液是最佳选择。
确定最佳的封闭液和浓度是免疫检测成功的关键步骤，合适的条件可提高成像的信噪比，也就是图像质量。
低浓度的封闭液可能导致高背景即膜发黑。
另一方面，过量的封闭液可以影响抗体和抗原的结合。